Promoties Geneeskunde

Korte samenvatting:

Paragangliomen zijn als tumor vaak niet erg gevaarlijk, maar ze vertegenwoordigen wel het klassieke kankermodel. De aanzet tot tumorgroei in deze kleine orgaantjes rondom enkele zenuwen wordt namelijk gegeven door een genmutatie, die ongeremde celdeling, afwezigheid van geprogrammeerde celdood en een veranderde genexpressie tot gevolg heeft. Pieter Bas Douwes Dekker heeft daarom toch besloten om deze paragangliomen te onderzoeken, met name diegene die ontstaan uit cellen waarin de zuurstofhuishouding niet optimaal functioneert. Hierdoor heeft hij ook een verband gelegd tussen paragangliomen en een gezwel in de bijnieren, dat tot een overmatige productie van adrenaline leidt.

Samenvatting:

Paragangliomen zijn zeldzame vaatrijke tumoren die ontstaan uit paraganglia, kleine orgaantjes die gegroepeerd zijn rond de lange banen van het autonome zenuwstelsel. Er worden twee verschillende typen paraganglia onderscheiden: het eerste type is geassocieerd met het sympathische deel van het autonome zenuwstelsel en de paraganglia hiervan zijn gelokaliseerd in de borstholte en buikholte met als voornaamste station het bijniermerg. Tumoren die uit deze paraganglia of bijniermerg ontstaan zijn vaak hormonaal actief en worden vaak aangeduid als feochromocytoom. Het tweede type paraganglia is geassocieerd met het parasympathische deel van het autonome zenuwstelsel en is voornamelijk gelegen in het hoofd hals gebied. Het voornaamste paraganglion is het carotid body dat is gelegen in de vork van de grote halsslagader (arteria carotis). Het functioneert als een chemoreceptor en registreert de zuurstofspanning in het bloed en is verbonden met het ademhalingscentrum in de hersenstam. Tumoren die uit hoofd-hals-paraganglia ontstaan, staan bekend als hoofd-hals-paragangliomen (syn.: glomustumor of chemodectoom). Zij vertonen in de regel een indolent gedrag en groeien in het algemeen zeer langzaam. Vanwege hun kritische lokalisatie dichtbij slagaders en hersenzenuwen kunnen zij echter aanzienlijke morbiditeit veroorzaken (vnl. hersenzenuwuitval).  Bovendien kan in uitzonderingsgevallen snelle groei en uitzaaiing wel degelijk optreden.

De ontwikkeling van hoofd-hals-paragangliomen is vaak erfelijk bepaald waarbij de overerving een bijzondere eigenschap vertoont: alleen als de erfelijke eigenschap wordt doorgegeven via een mannelijke drager zal bij het nageslacht tumorvorming optreden. Overdracht via een vrouw leidt nooit tot tumorvorming bij haar kinderen maar zij blijven wel drager van de aandoening. Deze geslachtsspecifieke overerving wordt aangeduid als genomische imprinting. Bovendien ontwikkelen patiënten met erfelijke paragangliomen vaak tumoren op meerdere locaties en doorgaans op jongere leeftijd.

Recent zijn via genetisch familieonderzoek de verantwoordelijke mutaties geïdentificeerd die betrokken zijn bij het ontstaan van erfelijke paragangliomen. Het betreft mutaties in genen van complex II (syn: succinaat dehydrogenase; SDH) dat een onderdeel vormt van de intracellulaire ademhalingsketen die zich bevindt in kleine celorganellen: de mitochondria. Vermoedelijk verstoren de mutaties de functie van complex II en daarmee de intracellulaire zuurstof registratie in paraganglion-cellen.

Welke mechanismen vervolgens verder betrokken zijn in het ontstaan van tumoren is nog onvoldoende bekend, maar er zijn aanwijzingen dat mogelijk een pseudo-registratie van zuurstofgebrek (pseudo-hypoxie) signaalroutes activeert die cellen stimuleren tot celdeling.

Behandeling van hoofd-hals-paragangliomen is in de regel chirurgisch. Dit is in sommige gevallen geen gemakkelijke opgave vanwege de innige relatie van de tumor met bloedvaten en hersenzenuwen en slecht toegankelijke operatiegebieden zoals de schedelbasis. Chirurgische verwijdering kan hierdoor worden gecompliceerd door bloeding of hersenzenuwuitval. Daarnaast is bij erfelijke patiënten regelmatig sprake van meerdere tumoren of is er verhoogd risico op ontwikkeling van nieuwe tumoren, zodat bij deze patiënten soms risico bestaat op dubbelzijdige hersenzenuwuitval (al of niet tgv chirurgische complicaties). Het natuurlijk beloop van hoofd-hals-paragangliomen is daarentegen in veel gevallen mild: de tumoren groeien zeer langzaam en geven lange tijd weinig klachten. Vanwege de complicatie risico’s en het dilemma van multipele tumoren wordt daarom regelmatig een afwachtend beleid gevoerd waarbij periodieke controles plaatsvinden (wait & scan) en alleen wordt besloten tot chirurgie bij toename van klachten of evidente groei (klinisch of radiologisch) van de tumor.

Ondanks de identificatie van eerder genoemde kiembaanmutaties bij erfelijke tumoren, is tot heden nog weinig bekend van de tumorbiologie van hoofd-hals-paragangliomen. Er zijn derhalve nog geen betrouwbare parameters beschikbaar waarmee de behandelend clinicus het natuurlijk gedrag van individuele tumoren kan voorspellen wat weer van belang kan zijn voor de behandelingsstrategie.

Dit proefschrift beschrijft een aantal studies waarin moleculair-pathologische aspecten van hoofd-hals-paragangliomen nader zijn bestudeerd teneinde de tumor biologie verder op te helderen.   

In Hoofdstuk 1 wordt een beknopt overzicht gepresenteerd van de huidige kennis en literatuur over het paraganglion-systeem en hoofd-hals-paragangliomen met focus op tumorbiologische aspecten.

De effecten van SDH-mutaties en de rol van complex II in de tumorvorming van hoofd-hals-paragangliomen zijn nader onderzocht in Hoofdstuk 2.  In 14 erfelijke paragangliomen en 8 sporadische tumoren is de SDH-activiteit bepaald met behulp van enzymhistochemie. Daarnaast werd in de tumoren de expressie van de twee enzymatische subunits van complex II, het flavoprotein (gecodeerd door SDHA) en het ironprotein (gecodeerd door SDHB), mbv immunohistochemie onderzocht. In een aantal tumoren werd het morfologische aspect van de mitochondria en de locatie van subunits met behulp van elektronenmicroscopie bestudeerd.

SDH-activiteit was afwezig in alle erfelijke tumoren zodat kan worden geconcludeerd dat SDH mutaties leiden tot afgenomen enzymactiviteit. Bovendien kon ook in het merendeel van de sporadische tumoren geen activiteit in de tumorcellen worden gedetecteerd, hetgeen erop duidt dat SDH-inactivatie kennelijk een algemeen verschijnsel is bij het ontstaan van paragangliomen. Verlies van SDH-activiteit lijkt daarbij samen te gaan met verminderde expressie van het ironprotein en er is sprake van een toename van het aantal mitochondria met een gezwollen aspect. Er blijken echter ook sporadische tumoren te zijn die dit patroon niet volgen en wel degelijk SDH-activiteit vertonen in combinatie met normale expressie van ironprotein. Hieruit kan worden afgeleid dat kennelijk ook andere mechanismen betrokken zijn bij tumorvorming.

De betrokkenheid van complex II-genen bij erfelijke paragangliomen heeft geleid tot nieuwe inzichten in de rol van de mitochondriale ademhalingsketen bij tumorvorming. Over de wijze waardoor het verminderd functioneren van complex II ten gevolge van mutaties tot proliferatie en tumorvorming leidt, bestaan verschillende hypothesen.  Vermoedelijk ontstaan door disfunctie van de ademhalingsketen reactieve zuurstof-vormen (reactive oxygen species) of pseudo-hypoxie in de chief cellen van paraganglia waarop een cascade van signalen wordt geïnitieerd die leidt tot activatie van factoren die cellen aanzet tot proliferatie. Een belangrijk signaal eiwit is vermoedelijk HIF 1a (hypoxia inducible factor 1a) dat een centrale rol lijkt te spelen in de respons van cellen bij hypoxie. Echter niet alle vormen van proliferatie lijken volledig door activatie van HIF 1a te kunnen worden verklaard. Een tweede factor waarvan bekend is dat het vaatnieuwvorming bij hypoxie stimuleert is bFGF (basic fibroblast growth factor). Bovendien blijkt deze factor in eerdere experimenten met gekweekte ‘”chief cellen” van carotid bodies proliferatie en overleving te stimuleren onder zuurstofarme condities. 

De expressie van bFGF en zijn receptor FGFR1 (fibroblastic growth factor receptor 1) is onderzocht in een serie van 8 normale carotid bodies en 34 paragangliomen door middel van immunohistochemie. De resultaten van deze experimenten worden besproken in Hoofdstuk 3. bFGF komt zowel in de carotid bodies als de tumoren sterk tot expressie. De receptor FGFR1 is aanwezig in normale carotid bodies maar komt versterkt tot expressie in de tumoren. Mogelijk is deze verhoogde expressie een reactie op (pseudo) hypoxische omstandigheden in de chief cellen en leidt dit tot een verhoogde gevoeligheid van de cellen voor het aanwezige bFGF. Binding van bFGF zou vervolgens de cellen kunnen stimuleren tot proliferatie of de cellen ongevoeliger kunnen maken voor geprogrammeerde celdood (apoptose).

Hoe een proliferatief signaal vervolgens leidt tot uiteindelijke tumorvorming in paragangliomen is goeddeels onbekend. Een klinisch belangrijk aspect van hoofd-hals-paragangliomen is daarbij de doorgaans uitzonderlijk langzame groei en het indolente gedrag van de tumoren. Verdere karakterisering van de processen die deze langzame groei bepalen kan in de toekomst leiden tot nieuwe parameters die het gedrag van tumoren voorspellen. Voor proliferatie en tumorgroei dienen tumorcellen zich te vermenigvuldigen via celdeling (mitose). Voorafgaand aan mitose dienen cellen de cel cyclus te doorlopen waarin verschillende checkpoints aanwezig zijn waar de voorbereiding van het delingsproces wordt gecontroleerd. Fouten en onregelmatigheden tijdens de cel cyclus kunnen leiden tot een arrest in een checkpoint of tot apoptose. Op deze wijze worden delingsfouten voorkomen die mogelijk leiden tot disfunctie of autonome groei. Veel tumoren zijn in staat om deze checkpoints te omzeilen of blijken ongevoelig voor apoptose.

In Hoofdstuk 4 zijn verschillende aspecten van de cel cyclus, proliferatie, en apoptose onderzocht in 42 erfelijke en sporadische hoofd-hals-paragangliomen.  De mate van proliferatie werd bepaald door meting van het aantal proliferende cellen met de marker Ki-67 waaruit een proliferatie index werd berekend. Deze bleek voor paragangliomen laag te zijn (~1%) en sluit goed aan bij de klinisch langzame groei.  De expressie van een aantal factoren dat een rol speelt in de cel cyclus en apoptose werd bestudeerd met behulp van immunohistochemie. In de tumoren lijkt het belangrijke regulerende eiwit p53 onaangetast zodat vermoedelijk verschillende checkpoints functioneren.  Bij veel tumoren zijn celpopulaties met een afwijkende DNA-inhoud aanwezig waarbij opvallend vaak sprake lijkt te zijn van verdubbeling of nagenoeg verdubbeling van het DNA (polyploidie), hetgeen duidt op een arrest in een laat checkpoint van de cel cyclus. Echter, in een TUNEL-assay bleek apoptose in de tumoren vrijwel afwezig te zijn, vermoedelijk door de aanwezigheid van het beschermende Bcl-x_L eiwit.

Aan de hand van deze bevindingen is een hypothetisch model opgesteld dat tumorvorming in hoofd-hals-paragangliomen kan verklaren. Vermoedelijk is er sprake van een functionerend checkpoint dat leidt tot een laat arrest in de cel cyclus waarbij de DNA-replicatie nagenoeg compleet is. De gearresteerde cellen zijn ongevoelig voor apoptose dankzij expressie van een beschermend eiwit en stapelen zich op. Vermoedelijk weten enkele cellen aan het arrest te ontsnappen om vervolgens opnieuw de cel cyclus te doorlopen. Dit resulteert in een kleine fractie proliferende cellen met een geringe potentie voor kwaadaardige (maligne) degeneratie.

Een intrigerend aspect van paragangliomen is de sterke histologische gelijkenis van de tumoren met het oorspronkelijke paraganglionweefsel. In veel gevallen vertonen de tumoren dezelfde architectuur en organisatie in celnesten (Zellballen) opgebouwd uit chief cellen met omgevende sustentacular cellen. Hoewel er consensus bestaat dat paragangliomen voornamelijk bestaan uit een neoplastische proliferatie van chief cellen blijft de aard en rol van de sustentacular cellen onduidelijk en controversieel. Sommige wetenschappers beschouwen paragangliomen als bifasische tumoren met twee verschillende typen tumorcellen terwijl anderen menen dat alleen de chief cellen neoplastisch zijn en dat sustentacular cellen afkomstig zijn uit het omgevende stroma. De aard van de sustentacular cellen is nader onderzocht in Hoofdstuk 5. Sustentacular cellen kunnen goed worden geïdentificeerd met de marker S-100. Door suspensies van tumorcellen te labelen met deze marker konden sustentacular cellen van de chief cellen worden gescheiden en gesorteerd in een flow cytometer. De sustentacular cellen bleken een normale DNA-inhoud te bezitten zonder verlies van wild-type SDHD allel terwijl chief cellen afwijkende DNA inhoud bezaten en het wild-type SDHD-allel hadden verloren.  Uit deze resultaten kan worden geconcludeerd dat de sustentacular cellen niet tot de tumorpopulatie behoren en waarschijnlijk een stromale oorsprong hebben. Derhalve zijn de chief cellen de enige neoplastische component in paragangliomen.

Naast hoofd-hals-paragangliomen omvat het tumorspectrum ook feochromocytomen. Deze tumoren zijn vaak hormonaal actief en hebben een grotere neiging tot  maligne gedrag. Naar analogie van mutaties in het SDHD-gen bij hoofd hals paragangliomen zijn in feochromocytomen ook mutaties in SDH-genen aangetroffen waarbij tot heden voornamelijk sprake bleek te zijn van afwijkingen in het SDHB-gen. Tot heden was echter onduidelijk in hoeverre SDHD-mutaties ook aanleiding geven tot ontwikkeling van feochromocytomen. In samenwerking met de afdeling  Endocrinologie is daarom een klinische studie verricht naar het synchroon voorkomen van feochromocytomen bij patiënten met SDHD-gerelateerde hoofd-hals-paragangliomen. De resultaten van deze studie worden besproken in Hoofdstuk 6. Bij 8 van 40 opeenvolgende patiënten met een SDHD-gerelateerd hoofd-hals-paragangliomen was sprake van een synchroon feochromocytoom. Bij vijf verwijderde feochromocytomen van deze patiënten bleek in de tumorcellen het wild type SDHD-allel verloren te zijn gegaan zodat alleen het gemuteerde SDHD-allel resteerde wat vermoedelijk aanleiding heeft gegeven tot de tumorontwikkeling. Geconcludeerd wordt dat ontwikkeling van feochromocytomen bij patiënten met SDHD- hoofd-hals-paragangliomen relatief frequent voorkomt en dat aanvullend onderzoek naar feochromocytomen bij deze patiënten geïndiceerd is.

De resultaten van dit proefschrift hebben geleid tot verder inzicht in verschillende facetten van de tumorbiologie van hoofd-hals-paragangliomen. Zo zijn de effecten van SDH-genmutaties in de tumorcellen nader onderzocht (genotype-fenotype relaties). Een mogelijke hypoxie-gerelateerde signaalroute via paracriene of autocriene effecten van bFGF in paragangliomen is nader bestudeerd.  De klinisch indolente groei van de tumoren is gecorreleerd aan een zwakke proliferatieve activiteit. Dit wordt mogelijk veroorzaakt door een combinatie van een zwakke mitogene stimulus met een functioneel checkpoint-arrest in de cel cyclus en een gebrek aan apoptose. Dit samen resulteert in een klein aantal prolifererende cellen met neiging tot polyploidisatie en geringe maligne progressie. Aanvullende studies dienen te worden verricht om dit hypothetisch model te toetsen en te verdiepen en zullen in de toekomst hopelijk leiden tot parameters die het klinisch gedrag van deze tumoren kunnen voorspellen. Daarnaast is de aard van sustentacular cellen en het mogelijk bifasische karakter van paragangliomen nader onderzocht. Uit genotypering van dmv flow-cytometrie gesorteerde celpopulaties  blijken de sustentacular cellen niet tot de tumorcellen te behoren maar vermoedelijk van stromale oorsprong te zijn. Derhalve moeten hoofd-hals-paragangliomen worden beschouwd als een monoklonale proliferatie van chief cellen. Als laatste is gebleken dat er sprake is van een aanzienlijke prevalentie (20%) van feochromocytomen bij patiënten die bekend zijn met SDHD-gerelateerd hoofd-hals-paragangliomen. Screenen op feochromocytomen bij deze groep patiënten lijkt dan ook geïndiceerd.

Summary:  

Head and Neck Paragangliomas (HNP) are hypervascular tumours characterised by a slow growth pattern and a strong hereditary context. The tumours originate from the neural crest derived paraganglia, which are associated with the autonomous nervous system and are situated at several locations in the head and neck region. Treatment strategies for these tumours have remained controversial. Especially in case of skull base tumours, radical surgical resection is often difficult to achieve and can be associated with complications such as peroperative haemorrhage or postoperative cranial nerve damage that result in considerable morbidity and loss of quality of life (cranial nerve palsy, CVA). These considerations are even more pertinent /important in hereditary cases, in which the patients often develop multiple tumours that would require several surgical procedures. Radiation therapy is being advocated and several studies have reported successful control of the disease. However these results may be attributable to the general slow growth of the tumours as most studies lack long-term follow-up of the patients. Because of the indolent growth pattern and benign behaviour of HNP, conservative approaches have become important alternatives in the treatment strategy. This is especially relevant in patients with multiple tumours where debilitating surgery could result in double sided cranial nerve palsy. Generally, in cases of vagal nerve tumours or glomus jugulare tumours, a policy of watchful monitoring & waiting is propagated, only intervening when obvious tumour progression or clinical deterioration is apparent.

Associated with the natural course of HNP is the strong hereditary context of these tumours. The identification of SDHD as suspecibility gene in hereditary HNP has lead to a novel concept of mitochondrial tumoursupressor-genes and further insight in the intricate association of cellular oxygen sensing mechanisms and (pseudo)-hypoxia as environmental risk factors in the development of these tumours as well as pheochromocytomas. However, further characterisation of the molecular pathology is warranted for better understanding of the natural behaviour of HNP and possible identification clinicopathological parameters that could aid the clinician in his treatment decisions. Additionally the relationship between SDH-linked HNP and the development of pheochromocytomas requires further investigation as the latter tumours can pose endocrinological threats as well as increased danger of malignant disease.

This thesis has focussed on the molecular pathology of HNP in order to gain further insight in intrinsic characteristics of these tumours. Additionally the relation of HNP and pheochromocytomas was further investigated in cooperation with the Department of Endocrinology.

Chapter 1 reviews the literature concerning HNP and contains general data concerning the disease. In the later paragraphs of this chapter the current concepts regarding molecular genetics and tumourigenesis in HNP are discussed with special reference to the tumoursuppressive nature of SDH-genes and possible pathways that may be involved in tumour development.

The discovery of mutations in genes encoding for subunits of complex II of the mitochondrial respiratory chain (SDH) in hereditary paragangliomas has lead to new insights in the development of HNP. The phenotypic consequences of these gene mutations are slowly becoming understood. In chapter 2 the SDH enzyme activity was studied in 22 SDHD-linked and sporadic HNP using an enzyme-histochemical technique.¹ As expected, in all SDHD-linked tumours SDH-activity was absent in the tumour-cells, demonstrating that SDHD-mutations indeed affect the function of complex II. Moreover SDH-activity was also reduced in the majority of sporadic cases, indicating that perturbed complex II function is generally involved in the development of HNP, irrespective of an underlying hereditary defect in one of the subunits. The loss of SDH-activity was found to be associated with aberrant expression of the two catalytic subunits of complex II in an immunohistochemical experiment. Immuno-electronmicroscopy showed disturbed mitochondrial morphology in HNP and confirmed the aberrant expression of these subunits within mitochondria. In most of the tumours studied, the flavoprotein subunit showed elevated expression whereas the expression of ironprotein subunit was generally reduced. However, in two sporadic cases SDH-activity was present in the tumour cells with concomitant immunohistochemical expression of the ironprotein. These findings suggest that the reduced expression of the ironprotein may be a direct consequence of prior events such as gene mutations in one of the anchor-subunits (SDHC and SDHD) and that the elevated expression of the flavoprotein may be regarded as an attempt to compensate for functional loss. This hypothesis is supported by the observation that SDHB gene mutations are also involved in hereditary paragangliomas and pheochromocytomas whereas SDHA-mutations cause a completely different disease-entity: Leigh’s syndrome. This syndrome is characterised by progressive neurodegenerative disease with clinical features such as optical atrophy, ataxia and myopathy but without predisposition for development of paragangliomas.^2,3 Interestingly, the two sporadic cases that retained SDH-activity and ironprotein-expression indicate that other mechanisms than complex II dysfunction may be operational in the development of paraganglioma.

Recent studies on phenotypic consequences of SDHB and SDHB-gene mutations have focussed on HIF associated pathways and report elevated expression of VEGF in tumours. However, as has been pointed out by several authors, this pathway probably does not fully account for tumour development in HNP and pheochromocytomas. In chapter 3 the role of the angiogenic growth factor bFGF was examined. The immunohistochemical expression of bFGF and its high affinity receptor FGFR1 was studied in 7 carotid bodies and 33 HNP.  bFGF was present in both carotid bodies and tumours confirming earlier reports. FGFR1 was moderately present in normal carotid bodies but the expression was increased in tumours possibly in response to (pseudo) hypoxic conditions. The increase of FGFR1-expression and the simultaneous presence of the ligand bFGF could indicate the existence of an autocrine or paracrine mechanism that may present an alternative pathway in the development of HNP⁴. Not only could bFGF impose a mitogenic signal in HNP, its actions may also enhance HIF-mediated pathways such as VEGF or increase apoptotic resistance through upregulation of anti-apoptotic Bcl-proteins.

In chapter 4 proliferation, apoptosis and aspect of the cell cycle were investigated to further characterise the molecular events that determine the extraordinary indolent growth pattern of HNP.⁵ In a series of 42 SDHD-linked and sporadic HNP an immunohistochemical study was performed with the proliferation marker Ki-67, cell cycle proteins p53 and p21^WAF, and the anti-apoptotic proteins Bcl-x_L. The presence of apoptosis was investigated with a TUNEL-assay in a subset of 10 tumours. Additionally, the DNA-ploidy of the tumours was determined with flow cytometry to examine the presence of DNA aberrations and signs of DNA synthesis, which may be indicative of possible cell cycle activity. The average proliferation index as calculated with Ki-67 was approximately 1% and is in accordance with the clinical slow growth of the tumours. The expression profile of p53 was not indicative for mutations of this important regulator of cell cycle control whereas the downstream cell cycle inhibitor p21^WAF was diffusely expressed among tumour cells. Flow cytometry showed DNA-aberrations in approximately 50 % of the tumours with a considerable percentage of cases with tetraploidy or a high G₂/M phase. These combined data suggest the presence of a small number of cycling cells with activation of cell cycle checkpoints that may have resulted in a G₂/M arrest. Apparently there is no strong selection pressure on relieving checkpoints that restrain enhanced proliferation in HNP. A possible explanation for such low selection pressure would be blocked apoptosis that prevents checkpoint-induced elimination. The TUNEL assay showed no signs of apoptosis suggesting that apoptotic activity is low or inhibited by the tumour cells. Lack of apoptosis could be due to expression of anti-apoptotic Bcl-protein Bcl-x_L that we observed in our series. Interestingly, several studies mention similar modes of action, in which expression of Bcl-x_L may overcome a p53 induced G2/M cell cycle arrest allowing arrested cells to escape and continue to proliferate, eventually leading to polyploidisation and tetraploidy.^6-8

Thus a combination of a weak mitogenic stimulus, functional cell cycle checkpoints and inhibited apoptosis could lead to a small fraction of proliferating tumour cells in which malignant degeneration is attenuated but allowing tumour cells to survive. Such a model could explain a slow growing tumour with a relative indolent behaviour as is generally observed in HNP.

A striking histological feature of paragangliomas is the frequent organisation of the tumour in Zellballen with chief cells and sustentacular cells that closely resembles the architecture of the normal paraganglion-tissue. Although there is general consensus that chief cells represent the major neoplastic component in HNP, the nature of sustentacular cells has remained obscure. The origin of sustentacular cells was investigated in chapter 5, using multi-parameter flow cytometry on 6 HNP.⁹ In this experiment the sustentacular cell-fraction was identified by labelling with S-100 and was found to be consistently diploid in aneuploid tumours. After cell sorting, the S-100 labelled cell fractions showed retention of the wild type SDHD-allele in contrast to the loss of heterozygosity in the aneuploid fractions in 3 SDHD-linked cases. These results demonstrate that sustentacular cells do not belong to the tumour cell population and are probably derived from stromal tissue. Chief cells thus represent the only neoplastic component in paragangliomas.

Apart from hereditary HNP, the spectrum of SDHD mutations also involves the development of pheochromocytomas. The prevalence of synchronic or metachronic pheochromocytomas among patients with confirmed SDHD-linked HNP was investigated in cooperation with the department Endocrinology. In chapter 6, the results of this study are presented.¹⁰ In a series of 40 patients referred with SDHD-linked HNP, 15 patients were found to have elevated catecholamine excess and in 9 of these patients (20% of all patients) a pheochromocytoma was detected. In a subset of extirpated pheochromocytomas, loss of heterozygosity of the SDHD wild type allele confirmed the association of SDHD mutations in the development of these tumours.

Conclusion

This thesis has focussed on the molecular biology and clinicopathological aspects of HNP and further characterized the events that lead to the development and behaviour of these tumours.

The recently discovered mutations in genes of subunits of complex II have created new insights in the molecular genetic events and the role of these tumorsupressor genes in HNP. SDH-dysfunction and destabilisation of complex II is present in SDHD-linked HNP but also in the majority of sporadic tumours and possibly is a common event in the development of paragangliomas in general. 

Recent studies on downstream pathways have shown the activation of HIF and expression of VEGF in tumours. However a paracrine or autocrine mechanism involving the angiogenic growth factor bFGF and the high affinity receptor FGFR1 may also contribute to tumour development in paragangliomas.  Apart from mitogenic signalling pathways, tumourigenesis was also investigated at the level of the cell cycle and the proliferation-index of the tumours was determined. Based on the results, a model is presented in which the combined effects of a weak mitogenic stimulus, active cell cycle control with induction of cell cycle arrest, and lack or inhibited apoptosis lead to a slowly proliferating population of tumour cells with progressive polyploidisation that has a low propensity for further (malignant) degeneration. (Chapter 4, figure 4.4)⁴ Further investigations will be required to confirm these events and may eventually lead to parameters that can predict the clinical behaviour of paragangliomas in the future.

In a separate study, the controversy regarding the nature of sustentacular cells in HNP has been resolved by demonstrating that this cell fraction does not belong to the tumour population and is presumably of stromal origin. Consequently, HNP should be regarded as a monoclonal proliferation of chief cells without biphasic properties.

Finally, in cooperation with the department of Endocrinology it has been demonstrated that a considerable number of patients with SDHD-linked HNP also develop pheochromocytomas. This finding warrants standard endocrinological examination of patients with SDHD-linked HNP. Further studies will be required to establish the penetrance of SDHD-linked pheochromocytomas and to determine the frequency of endocrinological screening for these tumours.

References

   1.   Douwes Dekker PB, Hogendoorn P, Kuipers-Dijkshoorn N et al. SDHD mutations in head and neck paragangliomas result in destabilization of complex II in the mitochondrial respiratory chain with loss of enzymatic activity and abnormal mitochondrial morphology. J Pathol 2003; 201(3):480-486.

   2.   Ackrell BA. Cytopathies involving mitochondrial complex II. Mol Aspects Med 2002; 23(5):369-384.

   3.   Baysal BE, Rubinstein WS, Taschner PE. Phenotypic dichotomy in mitochondrial complex II genetic disorders. J Mol Med 2001; 79(9):495-503.

   4.   Douwes Dekker PB, Kuipers-Dijkshoorn NJ, Baelde HJ, van der Mey AG, Hogendoorn PC, Cornelisse CJ. Basic fibroblast growth factor and fibroblastic growth factor receptor-1 may contribute to head and neck paraganglioma development by an autocrine or paracrine mechanism. Hum Pathol 2007; in press.

   5.   Douwes Dekker PB, Kuipers-Dijkshoorn N, Hogendoorn PC, van der Mey AG, Cornelisse CJ. G2M arrest, blocked apoptosis, and low growth fraction may explain indolent behavior of head and neck paragangliomas. Hum Pathol 2003; 34(7):690-698.

   6.   Minn AJ, Boise LH, Thompson CB. Expression of Bcl-xL and loss of p53 can cooperate to overcome a cell cycle checkpoint induced by mitotic spindle damage. Genes Dev 1996; 10(20):2621-2631.

   7.   Bunz F, Dutriaux A, Lengauer C et al. Requirement for p53 and p21 to sustain G2 arrest after DNA damage. Science 1998; 282(5393):1497-1501.

   8.   Margolis RL. Tetraploidy and tumor development. Cancer Cell 2005; 8(5):353-354.

   9.   Douwes Dekker PB, Corver WE, Hogendoorn PC, van der Mey AG, Cornelisse CJ. Multiparameter DNA flow-sorting demonstrates diploidy and SDHD wild-type gene retention in the sustentacular cell compartment of head and neck paragangliomas: chief cells are the only neoplastic component. J Pathol 2004; 202(4):456-462.

10.   van Houtum WH, Corssmit EP, Douwes Dekker PB et al. Increased prevalence of catecholamine excess and phaeochromocytomas in a well-defined Dutch population with SDHD-linked head and neck paragangliomas. Eur J Endocrinol 2005; 152(1):87-94.