Promoties Geneeskunde

Korte samenvatting:

Diabetes type 2 is gerelateerd aan overgewicht en komt tegenwoordig veel voor. Bij deze vorm van diabetes ontstaat er een verminderde gevoeligheid voor insuline. Annemieke Heijboer en Anita van den Hoek onderzochten of gevoeligheid voor insuline beinvloedt wordt door de verschillende darmhormonen en neuropeptiden die betrokken zijn bij de regulatie van voedselinname. Met hun onderzoek toonde zij aan dat het darmhormoon PYY via de hersenen insuline gevoeligheid kan verhogen. Deze conclusie geeft een belangrijke aanknoping voor de ontwikkeling van medicijnen tegen type 2 diabetes.

Samenvatting:

Het handhaven van constante glucose spiegels in het bloed is erg belangrijk voor de normale lichaamsfysiologie en in het bijzonder voor het centrale zenuwstelsel dat glucose als noodzakelijke brandstof gebruikt en geen endogene glucose voorraad heeft. Het hormoon insuline, uitgescheiden door de alvleesklier, is belangrijk bij het nauwkeurig reguleren van de glucose homeostase. Insuline remt de endogene glucose productie en stimuleert de glucose opname door perifere weefsels, zoals spier- en vetweefsel, en verlaagt daardoor glucose spiegels. In het geval van insuline resistentie zijn deze weefsels minder gevoelig voor de werking van insuline, wat gereflecteerd wordt door een verminderde remming van de endogene glucose productie en een verminderde remming van de glucose opname in de periferie bij gelijke insuline concentraties. In het begin zullen de beta cellen van de alvleesklier compenseren voor de insuline resistentie door de insuline secretie te verhogen. Echter, wanneer dit compensatoire mechanisme faalt, zullen hyperglycemie en type II diabetes volgen. Insuline resistentie is een dominant kenmerk van mensen met obesitas en type II diabetes. Zonder behandeling zal de hyperglycemie verergeren in de tijd, wat deze patienten gevoelig maakt voor het ontwikkelen van secundaire complicaties.
Tot nu toe is er slechts een schaarse hoeveelheid data beschikbaar over de fysiologische regulatie van insuline gevoeligheid door voedingsstatus in interactie met gastrointestinale hormonen en de hersenen. De voedingsstatus lijkt effect te hebben op insuline gevoeligheid. Recente studies hebben intensieve interacties tussen darmhormonen en hersenkernen in de regulatie van voedselinname laten zien. De nucleus arcuatus in de hypothalamus lijkt hier een centrale rol bij te spelen. Aangezien nauwkeurige regulatie van de glucose homeostase essentieel is in tijden van voedselschaarste, hebben we ons in dit proefschrift geconcentreerd op de fysiologische modulatie van insuline gevoeligheid, met speciale aandacht voor de rol van voedingsstatus (vasten, hoog vet dieet), darmhormonen (PYY, ghrelin), de hersenen en darm-brein interacties.

Voedsel status en insuline gevoeligheid
Tijdens de nuchtere staat en langdurig vasten is het extreem belangrijk om glucose spiegels hoog genoeg te houden om de hersenen te laten functioneren. Tijdens vasten stijgt de lipolyse in vetweefsel, wat resulteert in een verhoogde toevoer van vrije vetzuren naar de lever en spierweefsel. In lever en spierweefsel kunnen de vetzuren of gebruikt worden voor b-oxidatie of worden opgeslagen als triglyceriden. In het geval van b-oxidatie transformeert de lever de vetzuren in ketonen, die als energiebron kunnen worden gebruikt door de hersenen. Als de vetzuuropname groter is dan de b-oxidatie, zal een buitensporige triglyceriden-opslag de consequentie zijn. Bij obesitas zijn verhoogde vetzuurconcentraties en overmatige triglyceridenopslag geassocieerd met insuline resistentie. Vetzuurderivaten zijn liganden voor transcriptiefactoren zoals PPARs en SREBPs, die bekend staan om hun vermogen de expressie van enzymen/eiwitten betrokken bij het glucose en lipiden metabolisme te veranderen. Deze transcriptiefactoren hebben effecten op de insuline gevoeligheid. Het effect van vasten op weefsel-specifieke insuline gevoeligheid was onbekend. Daarom hebben we de effecten bestudeerd van 16 uur vasten (langdurig vasten) versus 4 uur vasten (postprandiaal) op insuline gevoeligheid van lever en spier in wildtype muizen in vivo, in relatie met weefsel-specifieke triglyceridenstapeling en met veranderingen in mRNA expressie van transcriptie factoren en gerelateerde eiwitten betrokken bij glucose en lipiden metabolisme (hoofdstuk 2). Totale en lever-specifieke insuline gevoeligheid werden gemeten met behulp van een hyperinsulinemische euglycemische clamp, in combinatie met D-[14C]glucose infusie. Voor het meten van weefsel-specifieke insuline gevoeligheid werd gebruik gemaakt van 2-deoxy-D-[3H]glucose. Zestien uur vasten had geen effect op de hepatische insuline gevoeligheid met betrekking tot de glucose productie in de aanwezigheid van een verhoogde triglyceridenstapeling in de lever (71±19 versus 12±7 µg/mg eiwit, p<0.01). In spier

Hoog vet dieet, insuline gevoeligheid en de hersenen Het westerse type dieet in onze huidige tijd bevat te veel vet. Dit hoog vet dieet is een risicofactor voor het krijgen van overgewicht, insuline resistentie en dus voor type II diabetes. Studies in ratten en honden op een hoog vet dieet laten de inductie van hepatische insuline resistentie als een vroege consequentie zien, wat later gevolgd wordt door insuline resistentie in de spier (1;2). De nucleus arcuatus integreert een groot aantal gedrags- en metabole aanpassingen aan voedselinname en gebrek aan voeding, wat nodig is om de energie homeostase te handhaven ondanks variaties in de beschikbaarheid van voedsel. Twee types neuronen in de nucleus arcuatus in hypothalamus zijn hoogst belangrijk voor de controle van deze processen: de eetluststimulerende neuronen die zowel AgRP als NPY tot uiting brengen, en de eetlustremmende neuronen die POMC/a-MSH tot uiting brengen. a-MSH bind aan en stimuleert melanocortine (MC) receptoren. Recente data van andere groepen en ook onze groep, laat zien dat het NPY/POMC circuit in de nucleus arcuatus betrokken is bij de modulatie van insuline gevoeligheid, onafhankelijk van de effecten van NPY/POMC op voedselinname. 

Het effect van een hoog vet dieet op weefsel-specifieke insuline gevoeligheid in muizen en triglyceridenstapeling, in relatie tot veranderingen in mRNA expressie van NPY, POMC, AgRP en CART in de hypothalamus is onbekend. Wij bestudeerden daarom de effecten hierop van 2 weken hoog vet dieet in wildtype muizen (hoofdstuk 3). Totale en lever-specifieke insuline gevoeligheid werden gemeten met behulp van een hyperinsulinemische euglycemische clamp, in combinatie met D-[14C]glucose infusie. Voor het meten van weefsel-specifieke insuline gevoeligheid werd gebruik gemaakt van 2-deoxy-D-[3H]glucose. Twee weken hoog vet dieet liet hepatische insuline resistentie met betrekking tot de remming van de hepatische glucose productie zien (35±20% versus 61±23%, p<0.05), in de aanwezigheid van verhoogde triglyceridenstapeling in de lever (32 ±10 versus 12±6 µg/mg eiwit, p<0.05). Tijdens hyperinsulinemische omstandigheden was de totale glucose opname niet verschillend tussen de hoog vet gevoede groep en de controle groep (66±10 µmol/kg.min versus 59±8 µmol/kg.min, ns), wat ook gereflecteerd werd door een onverandere spier-specifieke glucose opname in de hoog vet gevoede groep vergeleken met de controle groep (1.3±0.6 versus 1.3±0.3% per g tissue). We zagen geen veranderingen in hypothalame mRNA expressies van NPY, AgRP, POMC en CART in muizen na 2 weken hoog vet dieet vergeleken met controle muizen.
Uit deze studie kunnen we concluderen dat 2 weken hoog vet dieet in muizen mRNA expressies van NPY, AgRP, POMC of CART in de hele hypothalamus niet beinvloedt, ondanks inductie van hepatische, maar niet perifere, insuline resistentie. Omdat in onze studie mRNA expressies gemeten zijn in de gehele hypothalamus zonder regionale dissectie van de verschillende kernen, kunnen we de betrokkenheid van specifieke hypothalame kernen in de regulatie van hepatische insuline resistentie tijdens een hoog vet dieet niet totaal excluderen. Bovendien hebben we geen expressie niveaus van relevante eiwitten gemeten. Meer onderzoek is nodig om de mogelijke rol van de verschillende specifieke hypothalame kernen bij de regulatie van insuline gevoeligheid tijdens hoog vet diet te evalueren. 

Naast effecten op voedselinname, belemmert icv toediening van NPY ook acuut de capaciteit van insuline om de hepatische glucose productie te remmen. POMC lijkt ook betrokken te zijn bij de regulatie van insuline gevoeligheid. Chronische (7 dagen) icv infusie van a-MSH verbetert perifere en hepatische insuline gevoeligheid in ratten (3) en POMC overexpressie verbetert insuline resistentie in leptine deficiente muizen(4). In deze laatste studies doen de effecten op insuline gevoeligheid zich voor in de aanwezigheid van een begeleidende reductie in voedselinname en vetmassa, wat het maken van een onderscheid tussen vermeende directe effecten van POMC/a-MSH op insuline gevoeligheid en indirecte effecten via voedselinname en lichaamscompositie belet. Om de directe effecten van activatie van MC3/4 receptoren op de insuline gevoeligheid te documenteren, injecteerden we melanotan II (MTII), een agonist van deze MC3/4 receptoren, icv en kwantificeerden we hepatische en perifere insuline gevoeligheid van het glucose metabolisme in muizen zonder toegang tot voedsel (hoofdstuk 4). We hebben deze studie uitgevoerd in 24 uur gevaste muizen, die gedurende deze periode 3 keer een icv injectie kregen met MTII. Totale en lever-specifieke insuline gevoeligheid werden gemeten met behulp van een hyperinsulinemische euglycemische clamp, in combinatie met D-[3H]glucose infusie. Een real-time PCR werd gebruikt om mRNA expressie van GLUT4 in spierweefsel te meten. Hepatische insuline gevoeligheid was onveranderd, aangezien hyperinsulinemie de hepatische glucose productie van MTII- en vehicle behandelde muizen met gelijke hoeveelheid remde (45 ± 27% vs. 50 ± 20%, ns). De glucose opname snelheid was echter significant hoger in MTII behandelde muizen (151 ± 20 vs. 108 ± 20 µmol/min/kg, resp., p<0.01), in aanwezigheid van een verhoogde GLUT4 mRNA expressie in spier in de MTII behandelde groep vergeleken met de controle groep (307 ± 94 vs. 100 ± 56 %, p<0.01). 
Uit deze studie kunnen we concluderen dat activatie van centrale MC3/4 receptoren door MTII zorgt voor een verbetering van de insuline gevoeligheid met betrekking tot de totale glucose opname, onafhankelijk van voedselinname en lichaamsgewicht, terwijl er geen effect is op het vermogen van insuline om de endogene glucose productie te remmen. Deze observaties komen overeen met het concept dat steeds meer naar voren komt, dat neurale circuits, naast effecten op voedselinname, insuline gevoeligheid moduleren om metabole condities aan te passen in het aangezicht van fluctuaties in beschikbaarheid van voedingmiddelen.

Gastrointestinale hormonen en insuline gevoeligheid Gastrointestinale hormonen variëren afhankelijk van voedingsstatus en staan bekend om hun effect op voedselinname. Ter illustratie, PYY3-36 concentraties zijn laag tijdens vasten en verhoogd in de gevoede staat, terwijl ghrelin concentraties hoog zijn na vasten en net voor de maaltijd pieken. Dienovereenkomstig remt PYY3-36 voedselinname, terwijl ghrelin voedselinname stimuleert. Van gastrointestinale hormonen is bekend dat ze de eetlust kunnen beinvloeden door de regulatie van neuropeptides in de hypothalamus. Aangezien deze neuropeptides insuline gevoeligheid kunnen beïnvloeden, zouden gastrointestinale hormonen ook betrokken kunnen zijn bij de regulatie van insuline gevoeligheid.

PYY3-36
Aangezien PYY3-36 de neuronale activiteit van NPY remt en die van POMC stimuleert, vroegen we ons af of PYY3-36 insuline gevoeligheid kan verbeteren, onafhankelijk van de effecten op voedselinname en lichaamsgewicht. Daarom hebben we PYY3-36 intraveneus geinfuseerd en het glucose en lipidenmetabolisme gekwanitficeerd tijdens een hyperinsulinemische euglycemische clamp in muizen die 2 weken een hoog vet dieet hadden gegeten (hoofdstuk 5). Om insuline gevoeligheid met betrekking tot het glucose metabolisme van de lever en de periferie te meten werd een hyperinsulinemische euglycemische clamp, in combinatie met radioactief gelabeld glucose en 2-deoxy-glucose, uitgevoerd. Om de insuline gevoeligheid met betrekking tot het vetzuurmetabolisme te meten werd ook een hyperinsulinemische euglycemische clamp, in combinatie met 14C palmitaat, uitgevoerd. PYY3-36 verbeterde de door insuline geinduceerde glucose opname (103.8 ± 10.9 vs. 76.1 ± 11.4 µmol/min/kg, respectievelijk, p=0.001). Dienovereenkomstig was glucose opname in spier en vetweefsel tijdens hyperinsulinemische condities hoger gedurende PYY3-36 infusie, hoewel het verschil met de controle groep alleen statistische significantie bereikte voor spierweefsel (2.1 ± 0.5 vs. 1.5 ± 0.5 %/ g tissue, p<0.05). Daartegenover had PYY3-36 geen effect op de capaciteit van insuline om de endogene glucose productie te remmen (62 ± 29 vs. 42 ± 18%, ns). PYY3-36 had ook geen effect op actie van insuline met betrekking tot het vetzuur metabolisme, wat aangeduid werd door gelijke lipolyse snelheden gedurende hyperinsulinemie (22.4 ± 12.3 vs. 21.3 ± 10.9 µmol/min/kg, ns) in dieren die met PYY3-36 of vehicle zijn geinfuseerd. Uit deze studie kunnen we concluderen dat PYY3-36 de actie van insuline versterkt in muizen die op hoog vet dieet gehouden zijn, onafhankelijk van zijn effecten op voedselinname en lichaamsgewicht. In deze context blijkt PYY3-36 voornamelijk effect te hebben op insuline gemedieerde glucose opname, terwijl het de actie van insuline op de glucose productie grote
De waarde van PYY3-36 als een nieuw geneesmiddel hangt af van de duur van zijn effecten. Daarom hebben we onderzoek gedaan naar de lange termijn effecten van PYY3-36 (toediening gedurende 7 dagen, of continu via subcutane minipompjes of intermitterend via subcutane injectie eenmaal per dag) op insuline gevoeligheid (hoofdstuk 6). Totale en lever-specifieke insuline gevoeligheid werden gemeten met behulp van een hyperinsulinemische euglycemische clamp, in combinatie met D-[14C]glucose infusie. Weefsel specifieke insuline gevoeligheid werd gemeten met behulp van 2-deoxy-D[3H] glucose infusie. Lange termijn toediening van PYY3-36 leek geen nadelige of counterregulatoire effecten te hebben, aangezien lange termijn toediending dezelfde effecten liet zien als acute toediening, namelijk verhoogde perifere insuline gevoeligheid. Opmerkelijk genoeg was er geen verschil tussen continue en intermitterende toediening.

Ghrelin
Aangezien ghrelin zijn werking heeft in de hypothalamus, waar het NPY en orexine expressie stimuleert en POMC/a-MSH expressie remt via activatie van de growth hormone secretagogue (GHS) receptor, vroegen we ons af of ghrelin effect zou kunnen hebben op insuline gevoeligheid via deze GHS receptor. Om onze hypothese te staven, hebben we vehicle, ghrelin en growth hormone releasing peptide 6 (GHRP-6, een specifieke agonist van de GHS receptor) intraveneus toegediend in wildtype muizen en insuline gevoeligheid gemeten (hoofstuk 7). Tot voor kort werd geloofd dat acylatie van serine-3 van het ghrelin molecuul noodzakelijk zou zijn voor bioactiviteit. Recente data suggereren echter dat des-ghrelin ghrelin kan tegenwerken in de controle van de energie balans (5), en in vitro experimenten laten tegengestelde effecten van ghrelin en des-ghrelin op glucose productie in hepatocyten zien (6). Om de rol van des-ghrelin in de regulatie van energie fluxen verder te onderzoeken, hebben we de effecten van dit peptide in dezelfde context onderzocht. Totale en lever-specifieke insuline gevoeligheid werden gemeten met behulp van een hyperinsulinemische euglycemische clamp, in combinatie met D-[14C]glucose infusie. Weefsel specifieke insuline gevoeligheid werd gemeten met behulp van 2-deoxy-D[3H] glucose infusie. Hyperinsulinemie onderdrukte de endogene glucose productie significant minder in muizen die ghrelin kregen dan in de controles (controle: 71±11 %, ghrelin: 46±22 %, GHRP-6: 70±22 %; p<0.05). In tegenstelling, de glucose opname snelheid was significant hoger in de dieren die ghrelin ontvingen ten opzichte van de controle groep (controle: 59±8 µmol/kg/hour, ghrelin: 77±16 µmol/kg/hour, GHRP-6: 60±9 µmol/kg/hour; p<0.05), wat in overeenstemming was met de insuline gemedieerde 2-DG opname in spier en vetweefsel, welke hoger was in de met ghrelin behandelde dieren vergeleken met de controle groep (spier: control: 8.6 ± 4.4; ghrelin: 26 ± 21; GHRP-6: 7.1 ± 3.4 µmol/g weefsel, p<0.05), hoewel dit niet statistisch significant was 

Conclusies
De nucleus arcuatus in de hypothalamus speelt een centrale rol in de regulatie van eetlust en voedselinname. Tijdens vasten veranderen de expressies van neuropeptiden in de nucleus arcuatus die betrokken zijn bij de regulatie van voedselinname: expressie van het eetluststimulerende neuropeptide NPY stijgt, terwijl de expressie van het eetlustremmende neuropeptide POMC daalt, wat resulteert in de stimulatie van voedselinname. In gevoede toestand stijgt de expressie van POMC en daalt de expressie van NPY, wat resulteert in remming van voedselinname.
Recente studies laten zien dat de hersenen de eetlust en voedselinname regulerene in samenspraak met het maagdarmstelsel. De uitscheiding van gastrointestinale hormonen in het bloed varieert afhankelijk van voedingsstatus. Tijdens vasten stijgt de uitscheiding van ghrelin, een activator van NPY neuronen en een remmer van POMC neuronen, terwijl de uitscheiding van PYY3-36, een agonist van de presynaptische NPY Y2 receptor en daardoor een remmer van NPY neuronen en activator van POMC neuronen, vermindert, wat resulteert in een verhoogde voedselinname. In gevoede toestand worden tegenovergestelde effecten gezien.
Tot voor kort werd gedacht dat de regulatie van het glucose metabolisme het resultaat was van de samenspraak tussen lever, spier en vetweefsel met de alvleesklier en bijnieren, die glucoregulatoire hormonen produceren, met een hoofdrol voor insuline. Recente studies echter veranderden deze ‘perifere’ blik naar een meer ‘centraal’ concept met een prominente rol voor de hersenen die de glucose homeostase reguleren. Recente studies van Rossetti et al laten zien, dat chronische blokkade van insuline receptor signalen in de hypothalamus resulteert in hepatische insuline resistentie van de glucose productie, terwijl bij acute verwijdering van insuline receptoren in de lever het effect van fysiologische hyperinsulinemie op de snelheid van de glucose productie niet verandert (7-9). Deze studies laten zien dat insuline actie in de hersenen noodzakelijk is voor een intacte glucose homeostase.
De studies die uitgevoerd zijn binnen dit proefschrift laten zien dat de hersenen niet alleen voedselinname reguleren, maar ook insuline gevoeligheid van het glucose metabolisme in de lever en perifere weefsels, zoals spier en vetweefsel, afhankelijk en onafhankelijk van voedingsstatus en waarschijnlijk via gerelateerde veranderingen in gastrointestinale hormonen. Op deze manier kan op ieder moment de weefsel-specifieke insuline gevoeligheid nauwkeurig worden gereguleerd, afhankelijk en onafhankelijk van voedingsstatus. 
We hebben laten zien, dat vasten zelf resulteert in een verhoging van de spier-specifieke insuline gevoeligheid. Aangezien intraveneuze toediening van ghrelin in muizen ook een verhoogde spier-specifieke insuline gevoeligheid liet zien, kan worden gespeculeerd dat de effecten van vasten op de perifere insuline gevoeligheid gemedieerd worden door een verhoogde secretie van ghrelin, waarschijnlijk (gedeeltelijk) in samenspraak met de NPY/POMC neuronale circuits in de nucleus arcuatus. Interessant genoeg laten alle interventie studies, uitgevoerd door anderen en in dit proefschrift, weefsel-specifieke effecten van de verschillende interventies op insuline gevoeligheid zien. Van den Hoek et al lieten zien dat centrale infusie van NPY de insuline actie op hepatische glucose productie verminderde, zonder effecten op perifere insuline gevoeligheid (10). Centrale injecties van MTII (stimuleert het POMC pad), resulteerden in een verhoging van de perifere glucose opname zonder effect op hepatische insuline gevoeligheid. Intraveneuze toediening van ghrelin verhoogde de perifere insuline gevoeligheid, maar verlaagde de lever-specifieke insuline gevoeligheid. Intraveneuze infusie van PYY3-36 verhoogde de perifere insuline gevoeligheid maar had geen effect op hepatische insuline gevoeligheid.
Aangezien, bijvoorbeeld, vasten en ghrelin de perifere insuline gevoeligheid verhogen, terwijl NPY, dat ook geactiveerd wordt door vasten, geen effect heeft op perifere insuline gevoeligheid, maar hepatische insuline resistentie veroorzaakt, kunnen de effecten van vasten en ghrelin op de perifere gevoeligheid niet slechts verklaard worden door de modulatie van NPY neuronen. Echter, de inductie van hepatische insuline resistentie door ghrelin zou (gedeeltelijk) het resultaat kunnen zijn van de activatie van NPY neuronen door ghrelin.
Hoewel anderen hebben laten zien dat de regulatie van voedselinname door gastrointestinale hormonen wordt gemedieerd door de hersenen, blijft dit speculatief voor de regulatie van insuline gevoeligheid in het lichaam. Receptoren van gastrointestinale hormonen zijn overal in het lichaam te vinden, zowel centraal als perifeer. Uit de studies in dit proefschrift kunnen bovendien geen conclusies getrokken worden over de plaats van actie van gastrointestinale hormonen in het centrale zenuwstelsel. Er is meer onderzoek nodig, zoals perifere en centrale toediening van gastrointestinale hormonen in combinatie met blokkers van het NPY/POMC systeem en denervatie studies, om conclusies te trekken over de bijdrage van de hersenen en de plaats van actie in de hersenen met betrekking tot de regulatie van insuline gevoeligheid door veranderingen in concentraties gastrointestinale hormonen.
Aangezien glucose onontbeerlijk is als energiebron voor de hersenen, is de regulatie van voedselinname en insuline gevoeligheid van het grootst mogelijk belang voor de hersenen. Het is daarom niet verwonderlijk dat de hersenen zelf betrokken zijn bij de uiterst nauwkeurige regulatie van deze processen, om overleving veilig te stellen.


Reference List

1. Kim,SP, Ellmerer,M, Van Citters,GW, Bergman,RN: Primacy of hepatic insulin resistance in the development of the metabolic syndrome induced by an isocaloric moderate-fat diet in the dog. Diabetes 52:2453-2460, 2003
2. Kraegen,EW, Clark,PW, Jenkins,AB, Daley,EA, Chisholm,DJ, Storlien,LH: Development of muscle insulin resistance after liver insulin resistance in high-fat-fed rats. Diabetes 40:1397-1403, 1991
3. Obici,S, Feng,Z, Tan,J, Liu,L, Karkanias,G, Rossetti,L: Central melanocortin receptors regulate insulin action. J Clin.Invest 108:1079-1085, 2001
4. Mizuno,TM, Kelley,KA, Pasinetti,GM, Roberts,JL, Mobbs,CV: Transgenic neuronal expression of proopiomelanocortin attenuates hyperphagic response to fasting and reverses metabolic impairments in leptin-deficient obese mice. Diabetes 52:2675-2683, 2003
5. Asakawa,A, Inui,A, Fujimiya,M, Sakamaki,R, Shinfuku,N, Ueta,Y, Meguid,MM, Kasuga,M: Stomach regulates energy balance via acylated ghrelin and desacyl ghrelin. Gut 54:18-24, 2005
6. Gauna,C, Delhanty,PJ, Hofland,LJ, Janssen,JA, Broglio,F, Ross,RJ, Ghigo,E, van der Lely,AJ: Ghrelin stimulates, whereas des-octanoyl ghrelin inhibits, glucose output by primary hepatocytes. J Clin.Endocrinol.Metab 90:1055-1060, 2005
7. Buettner,C, Patel,R, Muse,ED, Bhanot,S, Monia,BP, McKay,R, Obici,S, Rossetti,L: Severe impairment in liver insulin signaling fails to alter hepatic insulin action in conscious mice. J Clin.Invest 115:1306-1313, 2005
8. Obici,S, Zhang,BB, Karkanias,G, Rossetti,L: Hypothalamic insulin signaling is required for inhibition of glucose production. Nat.Med. 8:1376-1382, 2002
9. Obici,S, Feng,Z, Karkanias,G, Baskin,DG, Rossetti,L: Decreasing hypothalamic insulin receptors causes hyperphagia and insulin resistance in rats. Nat.Neurosci. 5:566-572, 2002
10. van den Hoek,AM, Voshol,PJ, Karnekamp,BN, Buijs,RM, Romijn,JA, Havekes,LM, Pijl,H: Intracerebroventricular neuropeptide Y infusion precludes inhibition of glucose and VLDL production by insulin. Diabetes 53:2529-2534, 2004

Summary:  

Maintenance of plasma glucose concentration is highly important for normal body physiology, particularly for the central nervous system, which uses glucose as the obligatory fuel and has no endogenous glucose stores. The pancreatic hormone insulin is important in tightly regulating glucose homeostasis. Insulin inhibits endogenous glucose production and stimulates glucose uptake by peripheral tissues, like skeletal muscle and adipose tissue, and thereby lowers glucose levels. In conditions of insulin resistance, these tissues are less sensitive for insulin action, which is reflected in decreased inhibition of endogenous glucose production and decreased tissue glucose uptake at the same concentration of insulin. Initially, pancreatic beta cells compensate for insulin resistance by increasing insulin secretion. However, when this compensatory mechanism fails, hyperglycaemia and type II diabetes will ensue. Insulin resistance is a dominant feature in subjects with obesity and type II diabetes. Without treatment hyperglycaemia progresses in time, making these patients prone for developing secondary complications. 
Up till now, only scarce data are available upon physiological regulation of insulin sensitivity by feeding status, in interaction with gastrointestinal hormones and the brain. Feeding status seems to impact insulin sensitivity. Recent studies showed intensive interactions of gut hormones and brain centres in regulating food intake. The hypothalamic arcuate nucleus plays a central role in this interaction. Since fine-tuning of glucose homeostasis is essential to survive times of scarcity, the present thesis is focussed on physiological modulation of insulin sensitivity, with special emphasis on the role of feeding status (fasting, high fat diet), gut hormones (PYY, ghrelin), brain and gut-brain interactions.

Feeding status and insulin sensitivity
During the postabsorptive state and prolonged fasting it is extremely important to keep glucose concentrations high enough for functioning of the brain. During fasting, adipose tissue lipolysis increases, resulting in increased supply of FFA to the liver and muscle. In the liver and muscle, FFA can either be used for b-oxidation or TG storage. By b-oxidation, the liver transforms FFA in ketone bodies, which can be used as energy source by the brain. If tissue FFA uptake exceeds b-oxidation, excessive TG storage will be the consequence. In obesity, increased FFA concentrations and excessive tissue TG storage are associated with tissue insulin resistance. Fatty acid derivatives are ligands for nuclear transciption factors like PPARs and SREBPs, which alter the expression of enzymes/proteins involved in glucose and lipid metabolism and thus interact with insulin effects. The impact of fasting on tissue insulin sensitivity is unknown. Therefore, we studied the effects of 16 hours of fasting (prolonged fasting) versus 4 hr of fasting (postprandial state) on hepatic and muscle insulin sensitivity in wild-type mice in vivo in relation to tissue TG accumulation and changes in mRNA expression of transcription factors and related proteins involved in glucose and lipid metabolism (chapter 2). Whole-body and hepatic insulin sensitivity were measured by hyperinsulinaemic euglycaemic clamp in combination with D-[14C]glucose infusion. Tissue specific insulin sensitivity was measured by use of 2-deoxy-D[3H]glucose. Sixteen hr of fasting did not impact hepatic insulin sensitivity in terms of glucose production in the presence of increased hepatic triglyceride content (71±19 versus 12±7 µg/mg protein, p<0.01). In muscle, however, fasting resulted in increased insulin sensitivity with increased muscle glucose uptake (4.0±2.6 versus 1.3±0.3 % glucose uptake/ g tissue, p<0.01) without changes in muscle triglyceride content (25±7 versus 29±13 µg/mg protein, ns). In the liver, fasting resulted in increased mRNA expression of genes p
With regard to the physiological relevance of the increase in muscle insulin sensitivity during fasting, a state dominated by low insulin levels, it can be speculated that this mechanism might serve as an extremely efficient manner to prepare peripheral tissues metabolically to shift to glucose uptake, when the next meal arrives and insulin levels increase, thereby preventing glucose peaks after meals. 

High fat feeding, insulin sensitivity and the brain At present, the western type of diet contains too much fat. This high fat diet is a risk factor for overweight, insulin resistance, and, thereby, for type II diabetes. Studies in rats and dogs on a high fat diet show the induction of hepatic insulin resistance as an early event, followed by muscle insulin resistance (1;2). The arcuate nucleus integrates a multitude of behavioural and metabolic adaptations to food intake and starvation, necessary to maintain fuel homeostasis despite profound environmental variations in nutrient availability. Two types of neurons in the arcuate nucleus of the hypothalamus are of major importance for the control of these processes: the orexigenic neurons co-expressing AgRP and NPY, and the anorexigenic neurons expressing POMC/ a-MSH. a-MSH binds to and stimulates melanocortin (MC) receptors. Recent data from other groups and our own group showed involvement of the arcuate NPY/POMC circuitry in the modulation of insulin sensitivity, in addition to its impact on food intake.

The impact of a high fat diet on tissue specific insulin sensitivity in mice and triglyceride accumulation in relation to changes in mRNA expression levels of NPY, POMC, AgRP and CART in the hypothalamus is unknown. Therefore, we studied the effects of a 2 weeks high fat diet in wildtype mice on these parameters (chapter 3). Whole-body and hepatic insulin sensitivity were measured by hyperinsulinaemic-euglycaemic clamp in combination with D-[14C]glucose infusion. Tissue specific insulin sensitivity was measured by use of 2-deoxy-D[3H]glucose. Two weeks of high fat diet did show hepatic insulin resistance with regard to inhibition of hepatic glucose production (35±20% versus 61±23%, p<0.05) and in the presence of increased hepatic TG accumulation (32 ±10 versus 12±6 µg/mg protein, p<0.05). Under hyperinsulinemic conditions, whole body glucose uptake was not different between the HF fed group and the control group (66±10 µmol/kg.min versus 59±8 µmol/kg.min, ns), also reflected by unaltered muscle-specific glucose uptake in the HF fed group compared to the control group (1.3±0.6 versus 1.3±0.3% per g tissue). Muscle TG content was not significantly different either (27±9 versus 23±7 µg/mg protein, ns). We did not observe changes in hypothalamic mRNA expression levels of NPY, AgRP, POMC and CART after 2 weeks of high fat diet compared to control mice. 
From this study, we conclude that 2 weeks of high fat feeding in mice does not affect mRNA expression levels of NPY, AgRP, POMC or CART in the whole hypothalamus, despite induction of hepatic, but not peripheral, insulin resistance. Since in our study mRNA levels were measured in whole hypothalamus without regional assessment within the different nuclei, we cannot exclude involvement of certain specific hypothalamic area's in the regulation of hepatic insulin resistance during a high fat diet. In addition, we did not measure the expression levels of the relevant peptide levels. Additional studies have to be performed to evaluate the potential role of the respective nuclei within the hypothalamus in mediating peripheral insulin sensitivity during high fat feeding. 

In addition to the impact of NPY on food intake, icv administration of NPY acutely hampers the capacity of insulin to inhibit hepatic glucose production. The POMC pathway also seems to be involved in regulating insulin sensitivity. Chronic (7 days) icv infusion of a-MSH enhanced peripheral and hepatic insulin sensitivity in rats (3) and POMC gene overexpression ameliorates insulin resistance in leptin-deficient mice (4). In the latter studies, the effects on insulin sensitivity occur in the presence of a concomitant reduction in food intake and fat mass, which precludes distinction of putative direct effects of POMC/a-MSH on insulin sensitivity from indirect effects via feeding and body composition. To document the direct effects of activation of MC3/4 receptors on insulin sensitivity, we injected melanotan II (MTII), an agonist of these MC3/4 receptors icv, and quantified hepatic and peripheral insulin sensitivity of glucose metabolism in mice without access to food (chapter 4). We performed this study in 24 hour fasted mice, which received 3 times an icv injection with MTII during this period of time. Whole-body and hepatic insulin sensitivity were measured by hyperinsulinaemic euglycaemic clamp in combination with D-[3H]glucose infusion. A real time polymerase chain reaction (RT-PCR) was used to measure mRNA expression levels of GLUT-4 in skeletal muscle. Hepatic insulin sensitivity was unaltered as hyperinsulinaemia suppressed hepatic glucose production to a similar extent in MTII- vs. vehicle-treated animals (45 ± 27% vs. 50 ± 20%, ns). However, glucose disposal rate was significantly higher in MTII treated animals (151 ± 20 vs. 108 ± 20 µmol/min/kg, resp., p<0.01), in the presence of increased GLUT-4 mRNA expression in skeletal muscle in the MTII treated group compared to vehicle-treated mice (307 ± 94 vs. 100 ± 56 %, p<0.01). 
In conclusion, this study shows that activation of central melanocortin-3/4 receptors by MTII enhances insulin sensitivity of whole body glucose disposal, independently of food intake and fat mass, whereas it does not affect insulin's ability to suppress EGP. These observations are in line with the emerging notion, that neural circuits, apart from their effects on feeding, modulate insulin sensitivity to adapt metabolic conditions in the face of environmental fluctuations in nutrient availability.

Gastrointestinal hormones and insulin sensitivity Gastrointestinal hormones vary according to feeding status and are known to affect food intake. For instance, PYY3-36 concentration is low during fasting and increased in the fed state, whereas ghrelin concentration is high after fasting, and peaks just before a meal. Accordingly, PYY3-36 inhibits food intake whereas ghrelin stimulates food intake. Gastrointestinal hormones are known to influence appetite by regulating neuropeptides in the hypothalamus. As these neuropeptides can affect insulin sensitivity, gastrointestinal hormones might be involved in regulating insulin sensitivity as well. 

PYY3-36
In view of the fact that PYY3-36 inhibits NPY- and activates POMC neuronal activity, we wondered whether PYY3-36 can improve insulin sensitivity independently of its effects on food intake and body weight. Therefore, we infused PYY3-36 intravenously and quantified glucose and lipid metabolism during a hyperinsulinemic euglycemic clamp in mice that were fed a high fat diet for 2 weeks (chapter 5). To measure insulin sensitivity of hepatic and peripheral glucose metabolism, a hyperinsulinaemic euglycaemic clamp with radioactive labelled glucose and 2-deoxy-glucose was performed. To measure insulin sensitivity of FFA metabolism, a hyperinsulinaemic euglycaemic clamp, in combination with 14C-palmitate was performed. PYY3-36 enhanced insulin-induced glucose disposal (103.8 ± 10.9 vs. 76.1 ± 11.4 µmol/min/kg, respectively, p=0.001). Accordingly, 2-DG uptake in muscle and adipose tissue in hyperinsulinaemic conditions was higher during PYY3-36 infusion, although the difference with control reached statistical significance only for muscle (2.1 ± 0.5 vs. 1.5 ± 0.5 %/ g tissue, p<0.05). In contrast, PYY3-36 did not significantly impact insulin’s capacity to inhibit endogenous glucose production (62 ± 29 vs. 42 ± 18%, ns). Insulin action on FFA metabolism was not affected by PYY3-36 either, as indicated by similar lipolysis rates during hyperinsulinaemia (22.4 ± 12.3 vs. 21.3 ± 10.9 µmol/min/kg, ns) in PYY3-36 and saline infused animals. In conclusion, this study shows that PYY3-36 reinforces insulin action in mice maintained on a high fat diet, independent of its effects on food intake and body weight. In this context, PYY3-36 appears to predominantly impact insulin mediated glucose disposal, whereas it leaves insulin action on glucose production largely unaffected. These data suggest that PYY3-36 or synthetic analogues of this peptide may be valuable assets to our armamentarium of drugs designed to battle insulin resistance and type II diabetes mellitus.
The value of PYY3-36 as a new drug depends on the duration of its effects. Therefore, we investigated the long-term effects of PYY3-36 (administration of 7 days either continuously via subcutaneous mini-pumps or intermittent via subcutaneous injections once a day) on insulin sensitivity (chapter 6). Whole-body and hepatic insulin sensitivity were measured by hyperinsulinaemic euglycaemic clamp in combination with D-[14C]glucose infusion. Tissue specific insulin sensitivity was measured by use of 2-deoxy-D[3H]glucose. Long term PYY3-36 administration did not seem to have any adverse or counterregulating effects, as long term administration showed the same effect as acute administration: increased peripheral insulin sensitivity. Notably, there was no difference between continuous and intermittent administration. 

Ghrelin
As ghrelin acts in the hypothalamus where it promotes NPY and orexin gene expression and inhibits POMC/&#945;MSH expression via activation of the GHS-receptor, we wondered whether ghrelin might affect insulin sensitivity via the GHS-receptor. To address this hypothesis, we intravenously administered vehicle, ghrelin, or growth hormone releasing peptide 6 (GHRP-6, a specific agonist of the GHS-R), and measured insulin sensitivity in wildtype mice (chapter 7). Until recently, acylation of the serine-3 residue of the ghrelin molecule was believed to be required for bioactivity. However, recent data suggest that des-ghrelin may counteract ghrelin in the control of energy balance (5), and in vitro experiments revealed opposing effects of ghrelin and des-ghrelin on glucose production by primary hepatocytes (6). To further explore the role of des-ghrelin in the regulation of fuel flux, we studied the effects of this peptide in the same experimental context. Whole-body and hepatic insulin sensitivity were measured by hyperinsulinaemic euglycaemic clamp in combination with D-[14C]glucose infusion. Tissue specific insulin sensitivity was measured by use of 2-deoxy-D[3H]glucose. Hyperinsulinaemia suppressed EGP significantly less in animals that received ghrelin compared to controls (control: 71±11 %, ghrelin: 46±22 %, GHRP-6: 70±22 %; p<0.05). In contrast, glucose disposal rate was significantly higher in animals that received ghrelin compared to the control group (control: 59±8 µmol/kg/hour, ghrelin: 77±16 µmol/kg/hour, GHRP-6: 60±9 µmol/kg/hour; p<0.05), in accordance with insulin-mediated 2-DG uptake in muscle and adipose tissue, which was higher in ghrelin-treated animals, compared to the control group (muscle: control: 8.6 ± 4.4; ghrelin: 26 ± 21; GHRP-6: 7.1 ± 3.4 µmol/g tissue, p<0.05) although this difference did not reach statistical significance in adipose tissue (adipose tissue: control: 2.6 ± 1.7; ghrelin: 7.9 ± 11; GHRP-6: 3.6 ± 1.5 µmol/g tissue, p=0.09). With regard to des-ghrelin, during the hyperinsulina

Conclusions
The hypothalamic arcuate nucleus has a central role in the regulation of appetite and food intake. During fasting, expression of neuropeptides involved in the regulation of food intake in the arcuate nucleus change: expression of the orexigenic neuropeptide NPY increases, whereas expression of the anorexigenic neuropeptide POMC decreases, resulting in stimulation of food intake. Under fed conditions, expression of POMC increases, whereas expression of NPY decreases, resulting in a inhibition of food intake. 
Recent studies showed that the brain regulates appetite and food intake in crosstalk with the gut. Secretion of gastrointestinal hormones varies according to feeding status. During fasting, secretion of ghrelin, an activator of NPY neurons and inhibitor of POMC neurons, increases, whereas secretion of PYY3-36, an agonist of the presynaptic NPY Y2 receptor and thereby inhibitor of NPY neurons and activator of POMC neurons, decreases, resulting in increased food intake. During feeding, opposite changes occur. 
Until recently, it was thought that regulation of glucose metabolism was the result of crosstalk between the liver, muscle and adipose tissue with the pancreas and adrenals, producing glucoregulatory hormones, with a central role for insulin. Recent studies, however, changed this “peripheral” view to a more “central” concept with a prominent role for the brain regulating glucose homeostasis. Recent studies of Rossetti et al. showed that chronic blockade of hypothalamic insulin receptor signalling caused hepatic insulin resistance of glucose production, whereas acute depletion of insulin receptors in the liver failed to alter the effect of physiological hyperinsulinemia on the rate of glucose production (7-9). These studies show that brain insulin action is required for intact glucose homeostasis.
The studies performed in this thesis show that the brain not only regulates food intake but also insulin sensitivity of glucose metabolism in liver and peripheral tissues, like skeletal muscle and adipose tissue, dependently and independently of feeding status and likely via related changes in gastrointestinal hormones. In this way, at every moment, tissue insulin sensitivity can be fine-tuned, dependently and independently of feeding status. We showed that fasting itself resulted in an increase in muscle insulin sensitivity. Since intravenous administration of ghrelin in mice was shown to increase muscle insulin sensitivity as well, it can be speculated that the effects of fasting on peripheral insulin sensitivity are mediated by increased secretion of ghrelin, probably (partly) in crosstalk with the arcuate nucleus NPY/POMC neuronal circuitry. Interestingly, all intervention studies performed by others and in this thesis showed tissue specific effects of the different interventions on insulin sensitivity. Van den Hoek et al. showed that central infusion of NPY decreased insulin action on hepatic glucose production, without affecting peripheral insulin sensitivity (10). Central injections of MTII (stimulating the POMC pathway) resulted in an increase in peripheral glucose disposal without affecting hepatic insulin sensitivity. Intervenous administration of ghrelin increased muscle insulin sensitivity but decreased hepatic insulin sensitivity. Intravenous infusion of PYY3-36 increased peripheral insulin sensitivity as well, but had no impact on hepatic insulin sensitivity. Since, for example, fasting and ghrelin increase peripheral insulin sensitivity whereas NPY, which is also activated by fasting and ghrelin, has no effect on peripheral insulin sensitivity but induces hepatic insulin resistance, the effects of fasting and ghrelin on peripheral insulin sensitivity cannot merely be explained by modulation of NPY neurons. In contrast, the induction of hepatic insulin resistance by ghrelin might be (partly) the
Although it has been shown by others that regulation of food intake by gastrointestinal hormones is mediated by the brain, this remains speculative for the regulation of body insulin sensitivity. Receptors for gastrointestinal hormones are found throughout the body, both centrally and peripherally. From the studies in this thesis no conclusions can be drawn about the site of action of gastrointestinal hormones in the central nervous system. Therefore, more research, like peripheral and central administration of gastrointestinal hormones in combination with blockers of the NPY/POMC system and denervation studies, is needed to draw conclusions about the contribution of the brain and site of action in the brain with regard to the regulation of insulin sensitivity due to changes in gastrointestinal hormone levels. 
As the brain uses glucose as the obligatory fuel, the regulation of feeding and insulin sensitivity is of major importance to the brain. It is therefore not surprising that the brain itself is involved in regulating these processes tightly to secure survival. 


Reference List

1. Kim,SP, Ellmerer,M, Van Citters,GW, Bergman,RN: Primacy of hepatic insulin resistance in the development of the metabolic syndrome induced by an isocaloric moderate-fat diet in the dog. Diabetes 52:2453-2460, 2003
2. Kraegen,EW, Clark,PW, Jenkins,AB, Daley,EA, Chisholm,DJ, Storlien,LH: Development of muscle insulin resistance after liver insulin resistance in high-fat-fed rats. Diabetes 40:1397-1403, 1991
3. Obici,S, Feng,Z, Tan,J, Liu,L, Karkanias,G, Rossetti,L: Central melanocortin receptors regulate insulin action. J Clin.Invest 108:1079-1085, 2001
4. Mizuno,TM, Kelley,KA, Pasinetti,GM, Roberts,JL, Mobbs,CV: Transgenic neuronal expression of proopiomelanocortin attenuates hyperphagic response to fasting and reverses metabolic impairments in leptin-deficient obese mice. Diabetes 52:2675-2683, 2003
5. Asakawa,A, Inui,A, Fujimiya,M, Sakamaki,R, Shinfuku,N, Ueta,Y, Meguid,MM, Kasuga,M: Stomach regulates energy balance via acylated ghrelin and desacyl ghrelin. Gut 54:18-24, 2005
6. Gauna,C, Delhanty,PJ, Hofland,LJ, Janssen,JA, Broglio,F, Ross,RJ, Ghigo,E, van der Lely,AJ: Ghrelin stimulates, whereas des-octanoyl ghrelin inhibits, glucose output by primary hepatocytes. J Clin.Endocrinol.Metab 90:1055-1060, 2005
7. Obici,S, Zhang,BB, Karkanias,G, Rossetti,L: Hypothalamic insulin signaling is required for inhibition of glucose production. Nat.Med. 8:1376-1382, 2002
8. Obici,S, Feng,Z, Karkanias,G, Baskin,DG, Rossetti,L: Decreasing hypothalamic insulin receptors causes hyperphagia and insulin resistance in rats. Nat.Neurosci. 5:566-572, 2002
9. Buettner,C, Patel,R, Muse,ED, Bhanot,S, Monia,BP, McKay,R, Obici,S, Rossetti,L: Severe impairment in liver insulin signaling fails to alter hepatic insulin action in conscious mice. J Clin.Invest 115:1306-1313, 2005
10. van den Hoek,AM, Voshol,PJ, Karnekamp,BN, Buijs,RM, Romijn,JA, Havekes,LM, Pijl,H: Intracerebroventricular neuropeptide Y infusion precludes inhibition of glucose and VLDL production by insulin. Diabetes 53:2529-2534, 2004