Promoties Geneeskunde

Korte samenvatting:

Heeft de mechanische rek door overbelasting van hartcellen invloed op deze cellen en hoe verhoudt deze stress zich tot andere stressfactoren? 
Van der Wees vergelijkt de mechanische rek met twee andere stressfactoren: UV- en röntgenstraling. De laatste twee blijken DNA-schade aan te richten in de hartcel, mechanische rek daarentegen leidt niet tot DNA-schade of apoptose. Vervolgens kijkt zij naar de invloed van mechanische rek in het bijzonder. De rek wordt gesignaleerd door receptoren, zogenaamde integrinen, die de verbinding maken tussen de omgeving buiten en binnen in de cel. Als gevolg hiervan vindt er “fosforylering” plaats in de cel, zo blijkt. 

Samenvatting:

De belangrijkste taak van het hart is om het organisme levenslang, onondoorbroken, van bloed te voorzien. Tijdens het leven staat ieder organisme, en tevens zijn organen, bloot aan diverse stress factoren, zowel van endogene- als exogene origine. Om te overleven moet op de juiste manier gereageerd worden op deze stress factoren. Gelukkig bezit het hart een groot scala aan mogelijkheden om zich aan te passen aan, onder andere, veranderingen in de doorstroming van het hart, veranderende belastingscondities en blootstelling aan toxische stoffen. 
In de studies beschreven in dit proefschrift is onderzoek gedaan naar de reactie van hartcellen op verschillende stressfactoren, in een poging zich aan te passen aan de nieuwe situatie. Het effect van mechanische stress is bekeken in de hoofdstukken twee, zes en zeven. Hoofdstuk twee is met name gericht op de relatie tussen mechanische stress en het ontstaan van apoptose, terwijl de hoofdstukken zes en zeven gewijd zijn aan de veranderingen in genexpressie die optreden onder invloed van mechanische stress. De invloed van DNA schade op de hartcellen is onderzocht en beschreven in de hoofdstukken vier en zeven. Als laatste is gekeken naar de invloed van stimulatie van de integrines, deze resultaten zijn weergegeven in hoofdstuk drie.
Een korte beschrijving van zowel de normale functie van het hart als de verschillende celtypen die in de hartspier aanwezig zijn wordt gegeven in hoofdstuk een. De cellen die in de in dit proefschrift beschreven studies gebruikt zijn, zijn de relatief grote myocyten en de kleinere fibroblasten. De myocyten beslaan de grootste massa van het hart en zijn verantwoordelijk voor de contractiele werking. Deze cellen verliezen kort na de geboorte van het organisme het vermogen om te delen en zijn terminaal gedifferentiëerd. Ongeveer 50% van de cellen in het hart bestaat uit fibroblasten, deze cellen produceren de extracellulaire matrix die verantwoordelijk is voor het instandhouden van de structuur (inclusief de stijfheid) van het hart. 
Een aantal factoren, bv een te hoge bloeddruk of het niet goed functioneren van een hartklep, kunnen een chronische overbelasting in het hart veroorzaken. Om te compenseren voor deze overbelasting gaat de hartspier groeien, dit noemen we hypertrofie. Hoewel deze hypertrofie in beginsel erg gunstig is, het verlaagt immers de stress op de wand van het hart, kan het uiteindelijk, als de overbelasting blijft voortduren en zowel de aanpassing als de functionele verandering niet langer voldoen, leiden tot hartfalen. Wanneer we op cellulair niveau kijken zien we dat de term hypertrofie van de hartspier duidt op overmatige groei van de myocyten en vermeerdering van de fibroblasten. Hoofdstuk een beschrijft kort de specifieke veranderingen die zijn waargenomen in zowel de myocyten als de fibroblasten tijdens de ontwikkeling van hypertrofie.
Er wordt steeds meer bewijs gevonden dat apoptose, ofwel geprogrammeerde celdood, van de myocyten een gevolg is van mechanische overbelasting. Een vermindering in het aantal myocyten zou kunnen bijdragen aan de verslechtering van de contractiliteit van het hart. Of dit echter de primaire oorzaak of een gevolg van het progressive disfunctioneren van het hart is, is nog niet duidelijk. Om meer duidelijkheid op deze vraag te krijgen hebben we in hoofdstuk twee gekeken naar de directe invloed van mechanische stress op het ontstaan van apoptose in de verschillende hartceltypen. Voor dit onderzoek zijn myocyten en fibroblasten uit de ventrikels van neonatale ratten gekweekt op flexibele bodems die pulserend werden opgerekt. Het idee achter dit onderzoek is dat verhoogde mechanische stress waargenomen wordt door specifieke mechanoreceptoren die het signaal doorgeven aan de cel, waar het, direct of indirect, apoptose kan induceren. De resultaten verkregen door observaties aan de morfologie van zowel de cel als de kern, proteolytische activiteit van caspase-3 en fragmentatie van het DNA, duiden er echter op dat mechanische stress niet direct leidt tot apoptose in hartcellen, noch in de myocyten noch in fibroblasten. Uit deze resultaten kunnen we concluderen dat, in het gebruikte in vitro systeem van gekweekte myocyten en fibroblasten, geen direct verband bestaat tussen mechanische stress en apoptose. We moeten er echter wel rekening mee houden dat de moleculaire cascades in het functionerende hart veel complexer zijn dan de bestudeerde cascades in de monolayer van gekweekte cellen. Met name het effect van de verminderde hartfunctie is extreem moeilijk na te bootsen in een celsysteem. 
Mechanische stimuli worden waargenomen door specifieke receptoren, die deze vervolgens vertalen en doorgeven aan de cel. Belangrijke kandidaateiwitten voor deze waarneming zijn de integrines in de membranen van de cel. Deze membraan eiwitten functioneren als receptoren voor extracellulaire eiwitten waardoor de cellen binden aan de extracellulaire matrix. Bovendien verbinden de integrines intracellulair het cytoskelet en de sarcomeer eiwitten waardoor de cel zijn vorm krijgt en er een regelmatige structuur van myofibrillen ontstaat.
De interactie tussen de extracellulaire eiwitten en de integrines, de zogenaamde receptor-ligand interactie, en de (in-) activatie van de signaal transductie paden die deze interacties tot gevolg hebben, zijn onderzocht en beschreven in hoofdstuk drie. Voor deze studie hebben we gebruik gemaakt van een pentapeptide, met een RGD (Arg-Gly-Asp) sequentie die normaal aanwezig is in een aantal matrix eiwitten. Dit RGD-peptide moduleert de cellulaire calcium huishouding op een dosis afhankelijke manier en kan geblokkerd worden met blokkers van het Ca2+ release kanaal (RyR2) van het sarcoplasmatisch reticulum (SR). De verhoging van de intracellulaire calcium concentratie als gevolg van RGD stimulatie treedt vrij langzaam op en lijkt het gevolg te zijn van stimulatie van Ca2+ release uit het SR. Naast de dosis afhankelijke verandering in de calcium huishouding veroorzaakt de toevoeging van RGD-peptide aan de celkweken een tijds- en dosis-afhankelijke verhoging van de intracellulaire NO concentratie. NO donoren, zoals natriumnitroprusside, verhogen de intracellulaire calcium concentratie en tevens kan deze verhoging, hoewel niet geheel, geblokkeerd worden door RyR2 blokkers. Het lijkt erop dat NO, hetzij via protein kinase G (PKG) activatie, of door NO-geïnduceerde nitrosylering van RyR2 en/of L-type calcium kanalen, een verhoging van de geleiding van één of beide kanalen veroorzaakt. Het feit dat de intracellulaire calcium verhogende effecten van het RGD-peptide en NO additief blijken te zijn, vormt een extra aanwijzing dat er onafhankelijke signaaltransductie paden geactiveerd worden die samenkomen op het niveau van RyR2.
Een eigenschap van het aanpassingsvermogen van het hart aan veranderende omstandigheden, is de mogelijkheid om de expressie van genen en bijgevolg de concentratie van de bijbehorende eiwitten te veranderen. Behalve dat is het hart ook in staat weer eiwitten produceren die normaal alleen tijdens de foetale ontwikkeling geproduceerd worden. 
Tegenwoordig kan de expressie van vele duizenden genen in een keer bestudeerd worden met behulp van DNA micro arrays. Een techniek die is toegepast in hoofdstuk zes en zeven om de respons van de myocyten en de fibroblasten op verschillende stress factoren te bepalen. Het onderzoek beschreven in hoofdstuk zeven is uitgevoerd om te kijken in hoeverre de stress reactie van hartcellen op mechanische stress, een hartspecifieke stress, vergeleken kan worden met het ontstaan van DNA schade, een meer algemene stress. Om DNA schade te veroorzaken is gebruik gemaakt van twee verschillende soorten straling. Als eerste zijn de celkweken blootgesteld aan ioniserende straling (IR), dat in patienten die radiotherapie ondergaan kan leiden tot een remodeling van het hart en een verminderde hartfunctie. De tweede straling die is toegepast, is UV-straling, dat, in tegenstelling tot IR, veel DNA replicatie en transcriptie blokkades veroorzaakt.
De gebruikte celkweken in hoofdstuk zeven bestonden uit een mix van zowel terminaal gedifferentiëerde myocyten als delende fibroblasten uit het hart van neonatale ratten. Om aan het eind van de kweek periode de verandering in genexpressie op de veschillende stress factoren van beide celtypen afzonderlijk te bepalen is gezocht naar een methode om de beide celtypen van elkaar te scheiden.
Om een goede scheiding te bereiken is gebruik gemaakt van centrifugaal elutriatie (hoofdstuk vijf). Door de stroomsnelheid door de elutriatiekamer te varieren kan een cel-fractie rijk aan fibroblasten (87±5% zuiver) en een myocyten verrijkte fractie (82±6% zuiver) verkregen worden. Ondanks het feit dat met deze techniek de niet-myocyten goed van de myocyten gescheiden kunnen worden, is ook gebleken dat na een langere periode van kweken (4-5 dagen) het kleine aantal niet-myocyten in de myocyten verrijkte kweek, zorgde voor een vermindering in het relatieve percentage myocyten. Om die reden is een tweede elutriatie protocol ontworpen, waarbij de myocyten van de niet-myocyten pas gescheiden zijn na een periode van 4-5 dagen co-kweken. Dit laatste elutriatie protocol, waarin de cellen pas aan het eind van het experiment van elkaar gescheiden worden, heeft als grote voordeel dat de effecten van identieke experimentele condities apart bestudeerd kunnen worden in myocyten en niet-myocyten.
De reactie op de drie verschillende stress factoren is gemeten door een co-kweek van cellen bloot te stellen aan een van de drie stress factoren en te vergelijken met een co-kweek van controle cellen. Na de cel scheiding met behulp van de elutriator zijn de differentiëel tot expressie gebrachte genen (omhoog- of omlaag gereguleerd ten opzichte van de niet behandelde controle cellen) geïdentificeerd en vergeleken met behulp van Affymetrix GeneChips. Vanwege het feit dat de totale verandering in expressie van functioneel gerelateerde genen meer zegt dan het expressie patroon van individuele genen, zijn de genen op de Affymetrix GeneChips ingedeeld in functionele groepen, gebaseerd op hun biologische functie of op de rol van het genproduct in algemene intracellulaire paden.
In reactie op alle drie de stress factoren zijn vele genen in de myocyt-verrijkte fractie omhoog gereguleerd (q<0.005), terwijl de meeste genen, die in de fibroblasten fractie veranderde expressie vertonen omlaag gereguleerd zijn. Dit verschil kwam het duidelijkst tot uiting na behandeling met MS. Het is hierbij wel belangrijk om te vermelden dat het percentage fibroblasten in de myocyten-verrijkte fractie van de cellen die MS hebben ondergaan groter was dan het percentage fibroblasten in de myocyten-verrijkte fractie die bestraald zijn door IR of UV. Hoewel het verschil in genexpressie niveau heel goed het gevolg kan zijn van het verschil in toxiciteit van de drie gebruikte stress factoren, moeten we niet het paracrine effect in de co-kweken vergeten. Met name het paracrine effect in de aan MS onderworpen myocyten-verrijkte fractie zou grote invloed kunnen hebben op de regulatie van genexpressie.
Uit de resultaten van deze studie kunnen we concluderen dat MS, UV en IR voornamelijk stress specifieke en cel-type specifieke genexpressie profielen induceren in fibroblasten en myocyt-verrijkte kweken van de hartjes van neonatale ratten. De functionele groepen, die verandering in expressie in een significant percentage van de genen laten zien suggereren tevens dat er bepaalde cellulaire paden zijn die geactiveerd worden na meer dan één stress factor.
De studie beschreven in hoofdstuk zes gaat verder in op de veranderingen in gen expressie die door MS geïnduceerd worden. MS speelt een belangrijke rol in de aanpassing aan hemodynamische overbelasting. Behalve dat het het kracht-lengte mechanisme en de homeometrische autoregulatie in werking zet, activeert MS signaalmechanismes die betrokken zijn bij de hypertrofe groei van de myocyten uit het hart. De gedachte dat MS zelf de primaire factor is voor de hypertrofe reactie wordt ondersteund door ex vivo experimenten. De studie beschreven in hoofdstuk zes is uitgevoerd om op te helderen of de veranderingen in genexpressie, die in vitro optreden als gevolg van MS, beschouwd kunnen worden als de initiatie van de hypertrofe reactie.
Om de reactie van gekweekte hartcellen op MS te bestuderen is de genexpressie van cellen die 24 uur een rekprotocol hebben ondergaan vergeleken met de genexpressie van een soortgelijke kweek die niet gerekt is. Het resultaat van dit experiment laat duidelijk zien dat het meerendeel van de genen nauwlijks tot expressie komt en dat MS daar geen verandering in brengt. Als we een false discovery rate (FDR) van 0.005 volgens de Benjamini-Hochberg analyse hanteren, blijkt dat MS ervoor zorgt dat de expressie van 130 genen omhoog en 15 genen omlaag gaat in een celpopulatie die zowel myocyten als fibroblasten bevat. Wanneer we deze resultaten vergelijken met de resultaten van een zuivere fibroblasten kweek, blijkt dat 15 van de 145 in expressie veranderde genen verschillen tussen de zuivere fibroblasten kweek en de gemengde celpopulatie; deze genen noemen we cel-type specifiek. De gemengde celpopulatie bestaat echter uit zowel myocyten als fibroblasten en het is dus onduidelijk of de waargenomen verandering in genexpressie wordt veroorzaakt door een reactie van de myocyten op de MS, of dat het een gevolg is van een paracrine interactie tussen de beide cel-typen, die door MS is geïnduceerd.
De genen waarvan de genexpressie omhoog gaat als gevolg van MS coderen voor eiwitten die een rol spelen in (I) de biosynthese van fosfolipiden en cholesterol, de twee belangrijkste componenten van de cel membraan, (II) de synthese van componenten van de extracellulaire matrix, en (III) intracellulaire calcium huishouding. Tevens gaat de expressie van genen coderend voor (IV) een aantal groeifactoren en receptoren voor deze groeifactoren en (V) myofibril eiwitten, omhoog.
Hoewel apoptose in relatie met hypertrofie van het hart genoemd wordt, leidde blootstelling van hartcellen aan MS gedurende 24 uur niet tot een toename in het aantal enkelstrengs DNA fragmenten. Tevens werd er geen verandering in de expressie van genen coderend voor pro-apoptotische eiwitten gevonden. Deze resultaten bevestigen de eerder in hoofdstuk twee gevonden conclusie dat er geen direct verband bestaat tussen MS en apoptose. Blijkbaar is apoptose geen onderdeel van het hypertrofe proces per se, maar speelt het een rol bij de overgang van hypertrofie naar hartfalen of in hartfalen alleen. Samenvattend ondersteunen de veranderingen in genexpressie, zoals beschreven in dit hoofdstuk, de gedachte dat MS één van de initiatiefatoren is van de hypertrofe reactie in het overbelaste hart.
Naast de invloed van hartspecifieke stressfactoren (MS en stimulatie van de integrines dmv RGD eiwitten), op zowel de myocyten als de fibroblasten hebben we ook gekeken naar het vermogen van deze cellen om schade aan het DNA te herstellen. De integriteit van het DNA is van groot belang voor het functioneren en overleven van de cel. Als gevolg van reacties in de cel of van buitenaf door chemische stoffen en straling wordt DNA echter voortdurend beschadigd. Vrijwel alle organismen, van bacteriën tot eukaryoten, bezitten een breed scala aan mogelijkheden om DNA schade te verwijderen en de oorspronkelijke sequentie te herstellen om op deze manier nadelige effecten van DNA beschadigingen te voorkomen. Hoewel de werking van DNA herstel mechanismen uitgebreid bestudeerd en beschreven is voor delende cellen, is er (nog) weinig bekend van de werking van DNA herstel in terminaal gedifferentiëerde cellen, zoals bv myocyten uit het hart. Het onderzoek beschreven in hoofdstuk 4 is daarom gewijd aan de vraag of gekweekte myocyten uit het hart schade aan het DNA kunnen herstellen. Om op een gecontroleerd manier schade aan het DNA aan te brengen in de gekweekte hartcellen hebben we gebruik gemaakt van een techniek die vaak toegepast wordt, namelijk bestraling met ultraviolet licht (UV). UV licht induceert voornamelijk cyclobutaan pyrimidine dimeren (CPD) en pyrimidine (6–4)-pyrimidone fotoproducten (6–4PP) in het DNA.
Een veelzijdig DNA herstel mechanisme, betrokken bij het verwijderen van allerlei soorten DNA schade, onder andere de DNA schade die ontstaat na blootstelling aan ultraviolet licht (UV), is nucleotide excissie repair (NER). NER bestaat uit twee processen die naast elkaar plaatsvinden: transcriptie gekoppeld herstel (TCR) dat verantwoordelijk is voor de verwijdering van schade in de afgeschreven streng van transcriptioneel actieve genen, en algemeen genoom herstel (GGR), dat verantwoordelijk is voor de verwijdering van schade in het hele genoom, inclusief DNA sequenties die niet tot expressie komen, waaronder de niet-afgeschreven streng van actieve genen. 
Uit onderzoek blijkt dat de mate van het herstel van UV-geïnduceerde schade niet gelijk is in de verschillende delen van het genoom. Zo worden in gekweekte knaagdiercellen CPD’s snel verwijderd van de afgeschreven streng van actieve genen. Deze schade wordt echter niet of nauwlijks verwijderd van de niet-afgeschreven streng, noch uit de inactieve sequenties van het genoom. Voor de efficiënte verwijdering van CPD’s door GGR is een eiwitcomplex vereist dat een beschadigd DNA bindende capaciteit (DDB) heeft en daarnaast een grote affiniteit bezit voor dit beschadigde DNA. Dit complex is opgebouwd uit twee subeenheden, DDB1 (p125) en DDB2 (p48). Wild type hamster cellen en een aantal primaire weefsels van hamsters en muizen missen deze beschadigd DNA bindende capaciteit en de expressie van p48, daarnaast worden deze cellen gekarakteriseerd door een defect in GGR van CPD.
Hoewel er al veel bekend is over NER in cellijnen en delende fibroblasten, zowel van humane- als knaagdier-origine, weten we nog weinig over NER en de expressie van p48 in terminaal gedifferentiëerde cellen. In hoofdstuk 4 hebben we ons bezig gehouden met de vraag wat de invloed is van cellulaire differentiatie op de efficiëntie van NER. Om deze vraag te bantwoorden hebben we de expressie van NER en de transcriptie van p48 bestudeerd in terminaal gedifferentiëerde myocyten en delende fibroblasten geïsoleerd uit dezelfde hartjes van neonatale ratten.
Uit dit onderzoek blijkt dat zowel myocyten als fibroblasten 6-4PP efficiënt verwijderen van het DNA maar dat het herstel van CPD door GGR slecht is. Beide cel-typen verwijderen bovendien CPD van de afgeschreven streng van actieve genen met TCR. Met andere woorden, myocyten en fibroblasten uit de hartjes van neonatale ratten bootsen het repair fenotype van knaagdiercellijnen na. Dit inefficiënte verwijderen van CPD van het hele genoom gaat gepaard met een lage, niet-detecteerbare, transcriptie van p48, een gen dat sinds kort geacht wordt van essentiëel belang te zijn voor het verwijderen van CPD van het hele genoom.
Samenvattend kunnen we zeggen dat de selective verwijdering van CPD van de afgeschreven streng van actieve genen laat zien dat de proliferatie status van de cel geen invloed heeft op het DNA herstel fenotype.
De in dit proefschrift beschreven studies bevestigen dat hartcellen, zowel de myocyten als de fibroblasten, in staat zijn om op de juiste manier om te gaan met exogene stress factoren. De reacties die in detail bestudeerd en beschreven zijn laten zien dat beide celtypen de stress kunnen waarnemen, doorgeven aan de kern van de cel en vervolgens de expressie van genen kunnen aanpassen, zodat de cellen op de stress kunnen reageren.
Het gebruik van gekweekte hartcellen voor het beschreven onderzoek heeft veel voordelen: het is een makkelijk hanteerbaar systeem, een versimpeling ten opzichte van het complete hart en het maakt het mogelijk om meerdere experimenten simultaan in series van kweken uit te voeren. Er kleven echter ook nadelen aan het gebruik van celkweken. Zo is het niet mogelijk om de 3-dimensionale structuur en de innervatie van het hart na te bootsen en is het erg moeilijk om de invloed van factoren uit het bloed te bestuderen. Toch blijft het in de toekomst nuttig om gebruik te maken van gekweekte hartcellen, met name om de mechanogevoelige paden, de paracrine interacties met de fibroblasten en de modificatie van de extracellulaire matrix als gevolg van deze factoren te bestuderen. Deze studies kunnen bijdragen aan de opheldering van de mechanismes die ten grondslag liggen aan de processen van vervorming van de hartkamers van patiënten met hartfalen.

Summary:  

The heart is built for life-long uninterrupted function, supporting blood flow through the organism. During life, the organism as well as its organs will become challenged by exogenous and endogenous stresses that should be coped with. To be able to adapt to stresses such as altered loading conditions, changes in myocardial perfusion and exposure to toxic agents, the heart possesses ample capabilities.
This thesis deals with the question how cardiac cells react to different stresses in an attempt to adapt to the new circumstances. In chapter two, six and seven we examined and decribed the effect of mechanical stress on cardiac cells. The chapters four and seven deal with the reaction of cardiac cells to DNA damage caused by either ionizing radiation or UV-irradiation. The last stress imposed to cardiac cells that was investigated, is integrin stimulation. The results of this study are restored in chapter three.
The normal function of the heart and the various cell types present in the organ are described briefly in chapter one. The cells used for the studies described in this thesis are the large cardiac myocytes, that make up most of the heart’s mass and are responsible for the contractile function, and the fibroblasts, that contribute to &#8776; 50% of the total cell number and produce the extracellular matrix that contributes to the heart’s tensile strength and stiffness.
Chronic overload of the heart that can be the consequence of high blood pressure or mitral valve insufficiency, induces a compensatory growth of the heart, termed hypertrophy. Although this hypertrophy is initially very beneficial, since it reduces wall stress, it can evolve into heart failure whenever overload sustains and the adaptation and functional alterations become insufficient. On the cellular level cardiac hypertrophy refers to supranormal growth of cardiac myocytes and hyperplasia of fibroblasts. During development of cardiac hypertrophy specific changes have been observed in both cell types, which are described briefly in chapter one.
Evidence accumulates that the response to mechanical overload includes apoptosis of cardiac myocytes. A decrease in the number of myocytes may contribute to impaired contractility of the whole heart, but whether this is the primary cause or the result of the progressive cardiovascular dysfunction remains unclear. To answer this question we investigated the direct effect of mechanical overload on the induction of apoptosis in cardiac myocytes and fibroblasts. For this purpose neonatal rat ventricular myocytes and fibroblasts were cultured on plates with deformable growth surfaces and subjected to pulsatile stretch. 

Our hypothesis is that the increased mechanical stimulus is sensed by specific mechanoreceptors, transduced into the cell where it could, directly or indirectly, activate the apoptotic pathway. The results from this study, however, indicate that mechanical stretch does not directly activate apoptosis in cultured cardiac myocytes and fibroblasts. Results that were based on observations of cellular and nuclear morphology, proteolytic activity of caspase-3, and fragmentation of DNA.
In conclusion, we could not find a direct link between mechanical stretch and apoptosis in an in vitro model system of cultured myocytes and fibroblasts. We recognize that in the working myocardium, molecular signalling cascades are much more complex than those in monolayer cultures. Particularly the effect of chronically reduced cardiac function appears to be difficult to reproduce in a cell experiment.
Specific mechanoreceptors will sense mechanical stimuli, transduce them into the cell, where they can (in)-activate a broad range of signalling pathways. Candidate structures that should sense myocardial stretch are the integrins in the myocyte cell membrane. These membrane proteins act as receptors to which extracellular proteins bind, whereby they anchore the myocytes to the extracellular matrix. Moreover, at the cellular side, the integrins bind to the cytoskeleton of the cell and to sarcomere proteins, thereby assuring a certain cell form and a regularly packaged structure of myofibrils, respectively. In chapter three we have focused on receptor-ligand interaction of integrins and subsequent signalling pathways. To examine these interactions integrins were stimulated with a soluble ligand, being a pentapeptide containing the RGD (Arg-Gly-Asp) sequence that is normally present in several extracellular matrix proteins.
Cellular calcium homeostasis is modulated in a dose dependent way by the RGD-peptide, and can be inhibited by blockers of the Ca2+ release channel (RyR2) of the sarcoplasmic reticulum (SR). The increase of [Ca2+]i in response to RGD stimulation is rather slow and is therefore considered to be mediated by Ca2+ release from SR via stimulation of RyR2 conductance. Besides modulating calcium homeostasis, addition of RGD to the cultures induced a time and dose dependent increase of [NO]i. NO-donors, like SNP, also induce an increase of [Ca2+]i, a response that is blocked by RyR2-blockers, although incompletely. It appears that NO, either via protein kinase G (PKG) activation or by NO-induced nitrosylation of RyR2 and/or L-type Ca2+ channels, causes increased conductance of one or both channel types. The Ca2+ raising effects of RGD-peptide and NO are additive, adding evidence to independent pathways that converge at the level of RyR2.
Mechanical stress (MS) plays an important role in the adjustment of the myocardium to hemodynamic overload. In addition to triggering the force-length mechanism and homeometric autoregulation, MS activates signaling mechanisms involved in hypertrophic growth of cardiac myocytes. The view that mechanical stress itself is the primary factor for hypertrophic response is supported by ex vivo experiments. 
A striking property of the adaptability of the myocardium to enhanced workload is its ability to change gene expression, thereby altering the concentration of proteins produced. In addition, the myocardial response may include initiation of production of proteins that are not produced normally, but had been produced during fetal life. In the study described in chapter six we tried to elucidate whether the changes in gene transcription due to mechanical stress in vitro can be considered to be the initiation of the hypertrophic response. For that purpose the responses of a mixed population of cardiac myocytes and fibroblasts and pure fibroblasts that had been subjected to a MS protocol for 24 h were compared to their controls that had not been stretched, but were similar otherwise. The results of this experiment demonstrate that the majority of genes is either hardly expressed or does not show any change in expression after subjecting the cells to MS. Upon applying a false discovery rate (FDR) control-level at 0.005 according to Benjamini-Hochberg, MS was associated with up-regulation of 130 genes and down-regulation of only 15 genes in the mixed cell population. When these results were compared with the results obtained from a pure fibroblast cultures, it became clear that the expression of only 15 out of 145 genes was different between the mixed cell-population and the pure fibroblast-population, and these were therefore called cell-type specific. However since the mixed cell population consists of both cardiac myocytes and fibroblasts it is unclear whether the observed changes in gene expression are the result of changes in gene expression in cardiac myocytes or whether they are caused by paracrine interactions between the two cell types.
The genes that demonstrate an up-regulation include genes encoding proteins that play a role in (I) biosynthesis of phospholipids and cholesterol, the two main components of the cell membrane, (II) synthesis of extracellular matrix components, (III) myofibrillar proteins, surprisingly only myosin heavy chain genes that were non-muscle subtypes, instead of muscle &#61538;-MHC, (IV) intracellular calcium handling and (V) several genes encoding growth factors and growth factor receptors.
Although apoptosis has been mentioned in relation to myocardial hypertrophy, exposure of cardiac cells to MS for 24 h did not induce an increase in single standed DNA (ssDNA) fragments nor a change in expression of genes encoding pro-apoptotic proteins. Apparently, apoptosis is not part of the hypertrophic process per se, but rather belongs to the transition phase of hypertrophy to heart failure, or to heart failure alone.
In summary the changes in gene expression described in this chapter, strengthen the view that MS is one of the initiation factors of the hypertrophic response observed in overloaded myocardium.
In the study described in chapter seven we set out to investigate how the stress response of cardiac cells to MS can be compared to genotoxic stresses induced by DNA damaging agents. For this purpose we choose ionising radiation (IR), which during mediastinal radiotherapy can result in cardiac tissue remodelling and diminished heart function, and ultraviolet radiation (UV) that, in contrast to IR induces high concentrations of DNA replication- and transcription-blocking lesions.
To identify and compare differentially expressed genes (upregulated or down-regulated when compared with untreated controls) in cardiac cells in response to the three stresses MS, IR or UV, cultures enriched for ventricular cardiac myocytes or fibroblasts were exposed to one of the three stressors. Differentially expressed genes were identified using Affymetrix GeneChips. Since overall changes in the expression of functionally related genes are more informative than the expression pattern of single genes, in the present study, genes were assigned to functional groups, based on biological function or on the role of a gene product, in common intracellular pathways.
In the responses to all three stressors, differentially expressed genes were mostly up-regulated (q<0.005) in cardiac myocyte-enriched fractions, while in cultures of fibroblasts the majority of changed genes were down-regulated, differences that were most pronounced following mechanical stress (MS). It is important to mention that the percentage of cardiac fibroblasts in the cardiac myocyte enriched fraction that was subjected to MS was higher than the percentage of cardiac fibroblasts in the cardiac myocyte-enriched fractions that were subjected to UV or IR. The differences in gene expression level might very well be caused by the differences in level of toxicity between the three stressors applied in this study. However one must not forget the effect of paracrine signalling in the co-cultures. Especially in the myocyte-enriched co-culture that is subjected to MS paracrine signalling might have great influence.
From this study we can conclude that MS, IR and UV mainly induce stress-specific and cell-type specific gene expression profiles in neonatal rat cardiac myocyte-enriched cultures and cultures of neonatal rat heart fibroblasts. Functional groups that show significant percentages of differentially expressed genes suggest that certain cellular pathways are activated after one or more stresses.
Besides the effect of cardiac specific stresses (MS and integrin stimulation) on both the cardiac myocytes and the cardiac fibroblasts, we also examined and described the ability of these cells to repair DNA damage. Many exogenous and endogenous stresses affect the preservation of nuclear DNA, of which the integrity is essential for the correct performance of many cellular processes. In virtually all organisms from bacteria to higher eukaryotes, several DNA repair pathways prevent the deleterious consequences of DNA damages. The DNA repair mechanisms that are operational have been examined and described extensively, but knowledge of DNA repair in terminally differentiated cells, such as cardiac myocytes, is scarce.
Chapter four is therefore devoted to the capacity of cultured cardiac cells to repair damage to their DNA. To intrThe heart is built for life-long uninterrupted function, supporting blood flow through the organism. During life, the organism as well as its organs will become challenged by exogenous and endogenous stresses that should be coped with. To be able to adapt to stresses such as altered loading conditions, changes in myocardial perfusion and exposure to toxic agents, the heart possesses ample capabilities.
This thesis deals with the question how cardiac cells react to different stresses in an attempt to adapt to the new circumstances. In chapter two, six and seven we examined and decribed the effect of mechanical stress on cardiac cells. The chapters four and seven deal with the reaction of cardiac cells to DNA damage caused by either ionizing radiation or UV-irradiation. The last stress imposed to cardiac cells that was investigated, is integrin stimulation. The results of this study are restored in chapter three.
The normal function of the heart and the various cell types present in the organ are described briefly in chapter one. The cells used for the studies described in this thesis are the large cardiac myocytes, that make up most of the heart’s mass and are responsible for the contractile function, and the fibroblasts, that contribute to &#8776; 50% of the total cell number and produce the extracellular matrix that contributes to the heart’s tensile strength and stiffness.
Chronic overload of the heart that can be the consequence of high blood pressure or mitral valve insufficiency, induces a compensatory growth of the heart, termed hypertrophy. Although this hypertrophy is initially very beneficial, since it reduces wall stress, it can evolve into heart failure whenever overload sustains and the adaptation and functional alterations become insufficient. On the cellular level cardiac hypertrophy refers to supranormal growth of cardiac myocytes and hyperplasia of fibroblasts. During development of cardiac hypertrophy specific changes have been observed in both cell types, which are described briefly in chapter one.
Evidence accumulates that the response to mechanical overload includes apoptosis of cardiac myocytes. A decrease in the number of myocytes may contribute to impaired contractility of the whole heart, but whether this is the primary cause or the result of the progressive cardiovascular dysfunction remains unclear. To answer this question we investigated the direct effect of mechanical overload on the induction of apoptosis in cardiac myocytes and fibroblasts. For this purpose neonatal rat ventricular myocytes and fibroblasts were cultured on plates with deformable growth surfaces and subjected to pulsatile stretch. 

Our hypothesis is that the increased mechanical stimulus is sensed by specific mechanoreceptors, transduced into the cell where it could, directly or indirectly, activate the apoptotic pathway. The results from this study, however, indicate that mechanical stretch does not directly activate apoptosis in cultured cardiac myocytes and fibroblasts. Results that were based on observations of cellular and nuclear morphology, proteolytic activity of caspase-3, and fragmentation of DNA.
In conclusion, we could not find a direct link between mechanical stretch and apoptosis in an in vitro model system of cultured myocytes and fibroblasts. We recognize that in the working myocardium, molecular signalling cascades are much more complex than those in monolayer cultures. Particularly the effect of chronically reduced cardiac function appears to be difficult to reproduce in a cell experiment.
Specific mechanoreceptors will sense mechanical stimuli, transduce them into the cell, where they can (in)-activate a broad range of signalling pathways. Candidate structures that should sense myocardial stretch are the integrins in the myocyte cell membrane. These membrane proteins act as receptors to which extracellular proteins bind, whereby they anchore the myocytes to the extracellular matrix. Moreover, at the cellular side, the integrins bind to the cytoskeleton of the cell and to sarcomere proteins, thereby assuring a certain cell form and a regularly packaged structure of myofibrils, respectively. In chapter three we have focused on receptor-ligand interaction of integrins and subsequent signalling pathways. To examine these interactions integrins were stimulated with a soluble ligand, being a pentapeptide containing the RGD (Arg-Gly-Asp) sequence that is normally present in several extracellular matrix proteins.
Cellular calcium homeostasis is modulated in a dose dependent way by the RGD-peptide, and can be inhibited by blockers of the Ca2+ release channel (RyR2) of the sarcoplasmic reticulum (SR). The increase of [Ca2+]i in response to RGD stimulation is rather slow and is therefore considered to be mediated by Ca2+ release from SR via stimulation of RyR2 conductance. Besides modulating calcium homeostasis, addition of RGD to the cultures induced a time and dose dependent increase of [NO]i. NO-donors, like SNP, also induce an increase of [Ca2+]i, a response that is blocked by RyR2-blockers, although incompletely. It appears that NO, either via protein kinase G (PKG) activation or by NO-induced nitrosylation of RyR2 and/or L-type Ca2+ channels, causes increased conductance of one or both channel types. The Ca2+ raising effects of RGD-peptide and NO are additive, adding evidence to independent pathways that converge at the level of RyR2.
Mechanical stress (MS) plays an important role in the adjustment of the myocardium to hemodynamic overload. In addition to triggering the force-length mechanism and homeometric autoregulation, MS activates signaling mechanisms involved in hypertrophic growth of cardiac myocytes. The view that mechanical stress itself is the primary factor for hypertrophic response is supported by ex vivo experiments. 
A striking property of the adaptability of the myocardium to enhanced workload is its ability to change gene expression, thereby altering the concentration of proteins produced. In addition, the myocardial response may include initiation of production of proteins that are not produced normally, but had been produced during fetal life. In the study described in chapter six we tried to elucidate whether the changes in gene transcription due to mechanical stress in vitro can be considered to be the initiation of the hypertrophic response. For that purpose the responses of a mixed population of cardiac myocytes and fibroblasts and pure fibroblasts that had been subjected to a MS protocol for 24 h were compared to their controls that had not been stretched, but were similar otherwise. The results of this experiment demonstrate that the majority of genes is either hardly expressed or does not show any change in expression after subjecting the cells to MS. Upon applying a false discovery rate (FDR) control-level at 0.005 according to Benjamini-Hochberg, MS was associated with up-regulation of 130 genes and down-regulation of only 15 genes in the mixed cell population. When these results were compared with the results obtained from a pure fibroblast cultures, it became clear that the expression of only 15 out of 145 genes was different between the mixed cell-population and the pure fibroblast-population, and these were therefore called cell-type specific. However since the mixed cell population consists of both cardiac myocytes and fibroblasts it is unclear whether the observed changes in gene expression are the result of changes in gene expression in cardiac myocytes or whether they are caused by paracrine interactions between the two cell types.
The genes that demonstrate an up-regulation include genes encoding proteins that play a role in (I) biosynthesis of phospholipids and cholesterol, the two main components of the cell membrane, (II) synthesis of extracellular matrix components, (III) myofibrillar proteins, surprisingly only myosin heavy chain genes that were non-muscle subtypes, instead of muscle &#61538;-MHC, (IV) intracellular calcium handling and (V) several genes encoding growth factors and growth factor receptors.
Although apoptosis has been mentioned in relation to myocardial hypertrophy, exposure of cardiac cells to MS for 24 h did not induce an increase in single standed DNA (ssDNA) fragments nor a change in expression of genes encoding pro-apoptotic proteins. Apparently, apoptosis is not part of the hypertrophic process per se, but rather belongs to the transition phase of hypertrophy to heart failure, or to heart failure alone.
In summary the changes in gene expression described in this chapter, strengthen the view that MS is one of the initiation factors of the hypertrophic response observed in overloaded myocardium.
In the study described in chapter seven we set out to investigate how the stress response of cardiac cells to MS can be compared to genotoxic stresses induced by DNA damaging agents. For this purpose we choose ionising radiation (IR), which during mediastinal radiotherapy can result in cardiac tissue remodelling and diminished heart function, and ultraviolet radiation (UV) that, in contrast to IR induces high concentrations of DNA replication- and transcription-blocking lesions.
To identify and compare differentially expressed genes (upregulated or down-regulated when compared with untreated controls) in cardiac cells in response to the three stresses MS, IR or UV, cultures enriched for ventricular cardiac myocytes or fibroblasts were exposed to one of the three stressors. Differentially expressed genes were identified using Affymetrix GeneChips. Since overall changes in the expression of functionally related genes are more informative than the expression pattern of single genes, in the present study, genes were assigned to functional groups, based on biological function or on the role of a gene product, in common intracellular pathways.
In the responses to all three stressors, differentially expressed genes were mostly up-regulated (q<0.005) in cardiac myocyte-enriched fractions, while in cultures of fibroblasts the majority of changed genes were down-regulated, differences that were most pronounced following mechanical stress (MS). It is important to mention that the percentage of cardiac fibroblasts in the cardiac myocyte enriched fraction that was subjected to MS was higher than the percentage of cardiac fibroblasts in the cardiac myocyte-enriched fractions that were subjected to UV or IR. The differences in gene expression level might very well be caused by the differences in level of toxicity between the three stressors applied in this study. However one must not forget the effect of paracrine signalling in the co-cultures. Especially in the myocyte-enriched co-culture that is subjected to MS paracrine signalling might have great influence.
From this study we can conclude that MS, IR and UV mainly induce stress-specific and cell-type specific gene expression profiles in neonatal rat cardiac myocyte-enriched cultures and cultures of neonatal rat heart fibroblasts. Functional groups that show significant percentages of differentially expressed genes suggest that certain cellular pathways are activated after one or more stresses.
Besides the effect of cardiac specific stresses (MS and integrin stimulation) on both the cardiac myocytes and the cardiac fibroblasts, we also examined and described the ability of these cells to repair DNA damage. Many exogenous and endogenous stresses affect the preservation of nuclear DNA, of which the integrity is essential for the correct performance of many cellular processes. In virtually all organisms from bacteria to higher eukaryotes, several DNA repair pathways prevent the deleterious consequences of DNA damages. The DNA repair mechanisms that are operational have been examined and described extensively, but knowledge of DNA repair in terminally differentiated cells, such as cardiac myocytes, is scarce.
Chapter four is therefore devoted to the capacity of cultured cardiac cells to repair damage to their DNA. To introduce DNA damage in cultured heart cells, a frequently used technique, being radiation with ultraviolet (UV) light, is employed. A versatile repair pathway in a wide variety of cells that is involved in the removal of a broad range of structurally unrelated DNA lesions, is nucleotide excision repair (NER). NER removes bulky lesions that distort the DNA helix, including the UV-induced cyclobutane pyrimidine dimers (CPD) and (6–4)-photoproducts (6–4 PP). Two NER subpathways have been identified, i.e. global genome repair (GGR) and transcription-coupled repair (TCR). GGR removes DNA lesions throughout the genome, whereas TCR acts specifically on DNA lesions in the transcribed strand of active genes. The efficiency of repair of DNA lesions by TCR and GGR in mammalian cells depends on a number of factors, including species, cell type and type of DNA lesion.
Efficient GGR of CPD in human cells requires a protein complex consisting of two protein subunits, DDB1 (p125) and DDB2 (p48), with DNA damage binding activity (DDB) having high affinity for damaged DNA. In wild type hamster cell lines and in several primary tissues from hamsters and mice binding activity and p48 expression are absent. Furthermore, these cells are all characterized by a deficiency in GGR of CPD.
Despite the knowledge of NER in human and rodent fibroblasts and established cell lines, little is known about NER and the expression of the p48 gene in terminally differentiated cells. Therefore in chapter 4 we addressed the question of NER efficiency and cellular differentiation by focusing on expression of NER and transcription of the p48 gene in terminally differentiated myocytes and proliferating fibroblasts isolated from the same hearts of neonatal rats. 
Myocytes and fibroblasts were found to carry out efficient removal of 6-4 PP but display poor repair of CPD by GGR. Furthermore both cell types were found to carry out TCR of CPD, thus mimicking the repair phenotype of established rodent cell lines. The inefficient repair of CPD at the genome overall level occurs in the absence of massive apoptosis, but goes along with an undetectable level of transcription of the p48 gene. Taken together, the selective removal of CPD from the transcribed strand of transcriptionally active genes demonstrates that proliferation status has no impact on repair phenotype: both terminally differentiated myocytes and proliferating fibroblasts from the rat heart exhibit efficient TCR and poor GGR. Moreover the poor GGR of CPD is due to the absence of p48 expression.
The studies reported in this thesis confirm that cardiac cells, both myocytes and fibroblasts have the capacity to respond adequately to exogenous stresses. The responses that have been studied in detail demonstrate that these cells possess systems that sense the stress, transmit its message to the cell interior, and alter gene expression, leading to appropriate reactions. 
The use of cardiac cells in culture to study these reactions has many advantages, such as simplicity compared to a complete heart, ease of handling, simultaneous experiments in series of cultures, as well as disadvantages, such as exclusion of innervation, blood-borne factors and 3-dimensional structure. Future studies with cardiac cells in culture are encouraged, particularly those addressing the mechanosensitive pathways, paracrine interaction between fibroblasts and myocytes, and the ways the extracellular matrix becomes modified by stresses. These studies may elucidate the mechanism behind the process of ventricular remodeling observed in patients with heart failure.
oduce DNA damage in cultured heart cells, a frequently used technique, being radiation with ultraviolet (UV) light, is employed. A versatile repair pathway in a wide variety of cells that is involved in the removal of a broad range of structurally unrelated DNA lesions, is nucleotide excision repair (NER). NER removes bulky lesions that distort the DNA helix, including the UV-induced cyclobutane pyrimidine dimers (CPD) and (6–4)-photoproducts (6–4 PP). Two NER subpathways have been identified, i.e. global genome repair (GGR) and transcription-coupled repair (TCR). GGR removes DNA lesions throughout the genome, whereas TCR acts specifically on DNA lesions in the transcribed strand of active genes. The efficiency of repair of DNA lesions by TCR and GGR in mammalian cells depends on a number of factors, including species, cell type and type of DNA lesion.
Efficient GGR of CPD in human cells requires a protein complex consisting of two protein subunits, DDB1 (p125) and DDB2 (p48), with DNA damage binding activity (DDB) having high affinity for damaged DNA. In wild type hamster cell lines and in several primary tissues from hamsters and mice binding activity and p48 expression are absent. Furthermore, these cells are all characterized by a deficiency in GGR of CPD.
Despite the knowledge of NER in human and rodent fibroblasts and established cell lines, little is known about NER and the expression of the p48 gene in terminally differentiated cells. Therefore in chapter 4 we addressed the question of NER efficiency and cellular differentiation by focusing on expression of NER and transcription of the p48 gene in terminally differentiated myocytes and proliferating fibroblasts isolated from the same hearts of neonatal rats. 
Myocytes and fibroblasts were found to carry out efficient removal of 6-4 PP but display poor repair of CPD by GGR. Furthermore both cell types were found to carry out TCR of CPD, thus mimicking the repair phenotype of established rodent cell lines. The inefficient repair of CPD at the genome overall level occurs in the absence of massive apoptosis, but goes along with an undetectable level of transcription of the p48 gene. Taken together, the selective removal of CPD from the transcribed strand of transcriptionally active genes demonstrates that proliferation status has no impact on repair phenotype: both terminally differentiated myocytes and proliferating fibroblasts from the rat heart exhibit efficient TCR and poor GGR. Moreover the poor GGR of CPD is due to the absence of p48 expression.
The studies reported in this thesis confirm that cardiac cells, both myocytes and fibroblasts have the capacity to respond adequately to exogenous stresses. The responses that have been studied in detail demonstrate that these cells possess systems that sense the stress, transmit its message to the cell interior, and alter gene expression, leading to appropriate reactions. 
The use of cardiac cells in culture to study these reactions has many advantages, such as simplicity compared to a complete heart, ease of handling, simultaneous experiments in series of cultures, as well as disadvantages, such as exclusion of innervation, blood-borne factors and 3-dimensional structure. Future studies with cardiac cells in culture are encouraged, particularly those addressing the mechanosensitive pathways, paracrine interaction between fibroblasts and myocytes, and the ways the extracellular matrix becomes modified by stresses. These studies may elucidate the mechanism behind the process of ventricular remodeling observed in patients with heart failure.