Promoties Geneeskunde

Korte samenvatting:

Leida Rozeman deed onderzoek naar kraakbeenvormende tumoren in het middendeel van het bot. Ze wilde onder meer weten of er verschillen zijn tussen de goedaardige variant (enchondroom) en de kwaadaardige variant (chondrosarcoom), waarbinnen drie stadia worden onderscheiden (graad I tot III). De kwaadaardigste bottumoren bleken meer gebruik te maken van de zuurstofloze manier om energie op te wekken (glycolyse). Ook bleken bij graad III tumoren de genen instabieler: ze vertoonden veel willekeurige veranderingen. De enchondromen die bij patiënten met de ziekte van Ollier door het hele lichaam optreden, bleken in haar onderzoek op moleculair niveau niet te onderscheiden van enchondromen die op zichzelf voorkomen. 

Samenvatting:

Chondrosarcomen zijn kwaadaardige kraakbeen-producerende tumoren. Deze tumoren zijn zeldzaam en groeien meestal langzaam. Het merendeel behoort - microscopisch gezien - tot de subgroep conventionele chondrosarcomen. Binnen deze groep worden er 3 graden van maligniteit onderscheiden (graad I-III). De tumoren met de hoogste graad hebben een slechtere prognose. Binnen de groep van conventionele chondrosarcomen zijn twee groepen te onderscheiden op basis van waar deze zich bevinden ten opzichte van het bot waarvan ze uitgaan en al of niet bestaan van een goedaardige voorloper. Het perifere chondrosarcoom dat altijd ontstaat aan het oppervlak in de kraakbeenkap van zijn goedaardige tegenhanger het osteochondroom, en het centrale chondrosarcoom dat primair centraal in het bot gelegen is en kan al of niet ontstaan zijn in een goedaardige voorloper, genaamd enchondroom. Deze centrale chondrosarcomen zijn het meest voorkomend (± 80%). Dit proefschrift concentreert zich op deze specifieke groep tumoren.
Enchondromen zijn meestal solitair, dat wil zeggen dat er per patiënt maar één tumor wordt gevonden. Er zijn echter patiënten waarbij meerdere van deze tumoren voorkomen. Deze mensen lijden aan een syndroom genaamd “enchondromatose”. Binnen dit syndroom wordt er onderscheid gemaakt tussen verschillende subtypen waarvan Morbus Ollier (M. Ollier) en het Maffucci syndroom het meest voorkomend zijn.
Naast graad is ook de lokalisatie in het skelet van de tumoren van belang voor de prognose. De tumoren gelegen in de botten van de vingers en tenen tonen, in tegenstelling tot wat hun histologie doet denken, een relatief gunstige prognose.

I. Expressie analyse van central chondrosarcomen
Het onderliggend mechanisme van de ontaarding van enchondromen naar laaggradige chondrosarcomen is onbekend. Ook zijn er geen moleculaire merkers bekend die kunnen helpen om het verschil tussen deze benigne en maligne tumoren te verduidelijken. Dit zou goed van pas komen omdat het verschil soms moeilijk vast te stellen is door de patholoog. Daarnaast is het histologische graderingsysteem wat wordt gebruikt voor deze tumoren niet altijd glashelder, doordat de histologische kenmerken die van belang zijn voor de gradering
verschillend geïnterpreteerd kunnen worden.
Chondrosarcomen zijn een van de weinige mesenchymale tumoren waarbij progressie in graad kan plaatsvinden. Het bestuderen van expressie niveaus in de verschillende graden kan daarom aanwijzingen geven wat betreft de mechanismen die betrokken zijn bij dit proces
van progressie en de daaraan gecorreleerde risico’s op metastase en tumor gerelateerd overlijden.
I.a. Specifieke (hypothese gerelateerde) expressie analyse RNA en eiwit expressie is onderzocht in de hoofdstukken 3 (CDKN2A), 5 (IHH en PTHLH
signaal transductie) en 6 (JUNB).
I.a.1. CDKN2A
Het gen (CDKN2A) coderend voor het eiwit genaamd p16 (betrokken bij de regulatie van cel groei en deling en zo genoemd naar aanleiding het molecuul gewicht van dit eiwit) ligt in een regio van het genoom (9p21; een gebied op de korte arm van chromosoom 9, band p21) dat gedeeltelijk verloren is gegaan in een deel van de centrale chondrosarcomen. Gecombineerde analyse van zowel het mogelijk verlies van de regio 9p21 en de mate van eiwitexpressie van p16 liet zien dat verlies van de regio en p16 eiwitexpressie voornamelijk iets is dat voorkomt in hooggradige chondrosarcomen (hoofdstuk 3). Er is echter geen relatie gevonden tussen het verlies van p16 eiwitexpressie, het verlies van het stukje genoom 9p21,
of de aanwezigheid van methylering van het gen (een mechanisme dat kan zorgen voor een verminderde eiwitexpressie). Daarom is er waarschijnlijk een ander, nog niet geïdentificeerd, mechanisme actief dat leidt tot verminderde expressie van p16. Verlies van het eiwit p16 speelt een rol in de progressie van chondrosarcomen. Dit is een gegeven dat ook beschreven is bij andere tumoren zoals het rondcel liposarcoom.
I.a.ii. JUNB
JUNB is een van de genen die een klein, maar niet significant, verschil heeft gegeven bij de vergelijking van M. Ollier gerelateerde graad II chondrosarcomen met solitaire graad II chondrosarcomen zoals beschreven in hoofdstuk 6. Het eiwit JUNB maakt deel uit van een familie van transcriptie factoren (factoren die op basis van hun kenmerken het afschrijven van genen zowel positief als negatief kunnen beïnvloeden), genaamd AP-1. Deze factor speelt een rol bij de controle van groei en differentiatie van kraakbeen. Muizen waarbij JunB experimenteel is uitgeschakeld laten een gereduceerde groei van zowel kraakbeen als botvormende cellen zien. 
Bij de analyse van JUNB eiwitexpressie in een grotere groep tumoren - opgesplitst in solitaire en M. Ollier gerelateerde tumoren - is er echter geen verschil gezien tussen deze twee groepen. Er is wel een verschil gevonden in eiwitexpressie tussen enchondromen en laaggradige
chondrosarcomen. Hierbij is een toename van expressie geconstateerd in de chondrosarcomen. Dit suggereert dat JUNB expressie mogelijk kan worden gebruikt om het onderscheid tussen enchondromen en laaggradige chondrosarcomen te maken. 
I.a.iii. IHH en PTHLH signaal transductie
In de hoofdstukken 1 en 2 wordt de signaaltransductie regelkring zoals die beschreven is voor Indian Hedgehog (IHH) en parathyroid hormoon-gelijkend hormoon (PTHLH) geïntroduceerd. IHH komt aan zijn naam omdat wanneer een eiwit dat er veel op lijkt, in de fruitvlieg word verwijderd dit leidt tot een larve met allemaal stekeltjes (engels: “hedgehog”), de naamgeving Indian komt van het feit dat dit gen als eerste werd ontdekt in India. De IHH/ PTHLH regelkring speelt een belangrijke rol in de normale groei en ontwikkeling van de groeischijf. In erfelijke osteochondromen, de goedaardige tegenhangers van perifere chondrosarcomen, is de signaaltransductie van deze regelkring beïnvloed door mutaties in de genen EXT1 en EXT2. Daarom zijn de expressie niveaus van moleculen betrokken bij
deze regelkring in enchondromen en centrale chondrosarcomen bestudeerd in hoofdstuk 5.1 De moleculen zijn bestudeerd op eiwit niveau (immunohistochemie) voor PTHLH, PTHR1 (de receptor voor PTHLH), BCL2 (een eiwit betrokken bij het geprogrammeerde sterfproces van de cel), p21, cycline D1 en cycline E (drie eiwitten betrokken bij de regulatie van de cel deling). Op RNA niveau is er gekeken naar IHH, PTCH (patched, de receptor van IHH), SMOH (smoothened, een eiwit dat vast kan zitten aan PTCH en een rol speelt bij het doorgeven van het signaal) en GLI2 (een eiwit dat codeert voor een transcriptie factor en eveneens een
rol speelt bij het doorgeven van het signaal)(Figuur 5.1). De data laten zien dat de IHH signaal transductie regelkring afwezig is in enchondromen en centrale chondrosarcomen, terwijl de PTHLH regelkring wel actief is. Er is geen verschil in expressie niveaus gevonden tussen enchondromen en graad I chondrosarcomen. Het lijkt er dus op dat de PTHLH regelkring geen belangrijke rol speelt in de overgang van enchondroom naar chondrosarcoom. Een hoger expressie niveau correlerend met toenemende hogere histologische graad is gevonden voor de eiwitten PTHR1 en BCL2. Dit suggereert dat deze eiwitten mogelijk een rol spelen in de tumor progressie.
I.b. Algemene gen expressie analyse
In hoofdstuk 6 zijn de RNA expressie niveaus van duizenden genen tegelijkertijd in
enchondromen en centrale chondrosarcomen gemeten, met cDNA microarray analyse. De progressie is onderzocht door het vergelijken van de expressie patronen per gen in graad I en graad III chondrosarcomen. Naast de veranderingen die al bekend zijn, zoals de afname van extracellulaire matrix genen (graad III chondrosarcomen zijn celrijker en hebben minder substantie liggen tussen de tumor cellen) werden er ook andere processen die significant verschillend zijn tussen de graad I en graad III chondrosarcomen gevonden. 
Een van deze processen is de energie huishouding. In graad III chondrosarcomen is er een lagere expressie van genen gevonden betrokken bij de oxidatieve fosforylering. Dit is een proces dat zorgt dat suikers samen met zuurstof (aëroob) worden omgezet in energie. Daarnaast is er in hooggradige tumoren een hogere expressie gevonden van genen betrokken bij de glycolyse. Glycolyse is het proces waarbij suiker wordt omgezet in energie, zonder dat er zuurstof wordt gebuikt (anaëroob). De toename van glycolyse is beschreven bij verschillende kanker soorten, en er wordt zelfs gesuggereerd dat het een kenmerk is van invasieve tumoren. De stimulering van het proces van glycolyse leidt mogelijk in de laaggradige tumoren tot een groeivoordeel, aangezien er in deze tumoren weinig bloedvaten (en dus zuurstof) aanwezig zijn. Bij toename in graad neemt ook de vaatingroei toe, waardoor er meer zuurstof beschikbaar is voor de cellen. De glycolyse die netto resulteert in minder energie per suiker molecuul, gaat echter niet omlaag. Waarschijnlijk zijn de cellen dus omgeschakeld van aërobe naar anaërobe energie voorziening tijdens progressie. Mogelijk leidt de verhoogde activiteit van de glycolyse tot een verlaging van de activiteit van de oxidatieve fosforylering. Andere verklaringen zijn dat tumorcellen de producten die vrijkomen bij de glycolyse nodig hebben, dat het proces van oxidatieve fosforylering niet goed functioneert (bijvoorbeeld door mutaties), of dat cellen de hoeveelheid vrije radicalen (een bijproduct van oxidatieve fosforylering dat het DNA aan kan tasten) willen beperken.

II. Genetische veranderingen in centrale chondrosarcomen 
Tot nu toe waren er weinig specifieke veranderingen van het genoom bekend in het geval van enchondromen en conventionele centrale chondrosarcomen (9p21, 12q). Vorige studies combineerden vaak de conventionele centrale chondrosarcomen en de perifere chondrosarcomen, waardoor mogelijke verschillen specifiek voor een van deze twee groepen moeilijk te detecteren zijn.
In hoofdstuk 3 is, gebaseerd op eerdere studies, het verlies van de regio 9p21 verder bestudeerd. Verlies hiervan lijkt specifiek te zijn voor conventionele centrale
chondrosarcomen. De regio bevat onder andere het gen CDKN2A, wat codeert voor het p16 eiwit (zie boven). Doordat het eiwit in sommige gevallen de ontwikkeling en groei van tumoren kan belemmeren, is dit gen vaak het doel van het verlies. Met behulp van 4 merkers, gelokaliseerd op chromosoom 9 rondom de regio waar het CDKN2A gene ligt, is aangetoond dat een kopie van deze regio is verloren in 15 van 39 chondrosarcomen. Er zijn geen mutaties in de genen CDKN2A en p14ARF (een gen dat gedeeltelijk overlap vertoont met CDKN2A)
gevonden in alle 47 geteste tumoren. Dit alles te samen suggereert dat dit gebied, met de genen CDKN2A en p14ARF, niet het doel van het verlies is, maar dat er in deze regio (9p21) een ander gen van belang is.
In hoofdstuk 7 wordt beschreven hoe over het gehele genoom onderzoek is gedaan met array-CGH (een experiment waarmee de mate van winst of verlies van het genetisch materiaal in een keer kan worden meten). Er is gekeken naar genomische afwijkingen in primaire tumoren: enchondromen, graad I, graad II en graad III chondrosarcomen. Hierbij is een toename in zowel het aantal als de uitgebreidheid van de veranderingen in tumoren van hogere graad gevonden. In het algemeen waren de afwijkingen van de enchondromen (alle drie gelokaliseerd in de botten van vingers en tenen) en de graad I chondrosarcomen beperkt en indien aanwezig klein, hoewel één van de enchondromen verlies vertoonde van geheel
chromosoom 6. In de hooggradige chondrosarcomen zijn beduidend meer, schijnbaar willekeurige, veranderingen waargenomen, alsof het genoom van deze tumoren instabiel is geworden. 
Geen van de veranderingen was aanwezig in alle geteste tumoren, maar er zijn wel veranderingen die werden gevonden in meerder tumoren. Door het toepassen van een scheidslijn waarbij minimaal 5 tumoren dezelfde veranderingen moeten bevatten zijn er 22 regio’s geïdentificeerd. De grootte van deze regio’s varieerde van 0.55 Mb tot 113 Mb. Enkele van deze regio’s zijn eerder genoemd in andere studies, terwijl andere nog niet eerder waren gerapporteerd. In het geval van de chromosomen 7, 12 en 20 zijn meerdere stukjes met verlies of winst gevonden. Op chromosoom 7 zijn dat de regio’s 7p12.3-p15.3, 7p11.2-q11.23, 7q36.1-q36.3, op chromosoom 12: 12p13, 12p11.21-p11.23 and 12q13 en op chromosoom 20: 20q11.21, 20q12, 20q13.33. Verdere analyse toonde aan dat winst of verlies van sommige chromosomen of chromosoom regio’s specifiek lijken te zijn voor progressie of prognose. Verlies van chromosoom 6 of 10 en winst van de regio 12q12 correleert met een hogere graad. Verlies van chromosoom 10 (10pter-10q25.3), 4q13, 4q34.3 en toename van 9q34 correleert met een slechtere prognose. 
Winst van genetisch materiaal op chromosoom 12 wordt waargenomen in meerdere tumorsoorten. Vooral in sarcomen, zoals osteosarcomen en liposarcomen, worden amplificaties van de regio 12q13-15 vaker gezien. In dit gebied liggen onder andere de genen CDK4, MDM2, SAS en genen van de familie van “high mobility group” eiwitten. Winst van de korte arm van chromosoom 12 (12p) wordt ook gezien in andere typen kanker, zoals bepaalde types kiembaan tumoren van de testis en pancreas carcinomen. In beide type tumoren wordt, net als in chondrosarcomen, amplificatie van 12p11 gevonden. Winst van 12p wordt gezien als een mogelijke stap naar verdere kwaadaardige progressie. 
Uiteindelijk zijn de resultaten van de cDNA expressie array (hoofdstuk 6) en die van de array-CGH (hoofdstuk 7) gecombineerd om te zien of het niveau van de gen expressie mee verandert met het verlies of winst van gedeeltes van het genoom. Er zijn twee genen geïdentificeerd, CDK4 (12q13) kwam hoger tot expressie in tumoren waarvan deze regio amplificatie vertoonde en RPS6 (9p21.3-p24.1) had lagere expressie niveaus in tumoren met verlies van deze regio. Deze data suggereren dat de hiergenoemde genen kandidaat zijn als
doelwit voor de gevonden winst en respectievelijk verlies.

III. Model voor tumorvorming
Met behulp van de hierboven staande data is een model voor tumor vorming van conventionele central chondrosarcomen opgesteld (Figuur 8.1). 
Bij de transformatie van enchondroom naar laaggradig chondrosarcoom wordt een toename van expressie van het eiwit JUNB gevonden (hoofdstuk 6). De progressie van laag- naar hooggradig chondrosarcoom wordt gekenmerkt door de verhoogde expressie van genen betrokken bij de glycolyse, gecombineerd met de afname in expressie van genen betrokken bij de oxidatieve fosforylering (hoofdstuk 6). Daarnaast wordt een toename van PTHR1 en BCL2 eiwitexpressie gezien met toename in histologische graad (hoofdstuk 5), terwijl de eiwitexpressie van p16 afneemt (hoofdstuk 3). Op genomisch niveau worden er geen verschillen waargenomen tussen enchondromen en laaggradige chondrosarcomen. Bij de
overgang van laag- naar hooggradige tumoren wordt verlies van chromosoom 6, 10 en amplificatie van de regio 12q12 gevonden, hoewel verlies van chromosoom 6 ook is gevonden in één van de drie enchondromen. Tevens nam het aantal en de grootte van de genomische veranderingen toe in de hooggradige tumoren, mogelijk door genomische instabiliteit (hoofdstuk 7). Het verlies van 4q13, 4q34, en 10pter-10q25 en de amplificatie van 9q34 bleken te correleren met een slechtere prognose (hoofdstuk 7).

IV. Conventionele centrale chondrosarcoma subtypes
Binnen de groep van conventionele centrale chondrosarcomen zijn er, gelet op de klinische data, verschillende subtypes te onderscheiden. Patiënten met chondrosarcomen gelokaliseerd in de botten van de vingers en tenen hebben een lagere kans op uitzaaiingen vergeleken met patiënten waarvan de tumoren soortgelijke histologische kernmerken vertonen, maar die elders gelokaliseerd zijn. Ook voor patiënten met enchondromatose, gekarakteriseerd door meerdere centraal in het bot gelegen kraakbeen-vormende tumoren, worden er als gevolg
van verschillend klinisch gedrag andere histologische criteria gebruikt, vergeleken met solitaire tumoren.
IV.a. Tumoren gelokaliseerd in vingers en tenen
In de hoofdstukken 5 en 6 zijn de RNA- en eiwit-expressieniveaus van tumoren gelokaliseerd in vingers en tenen (hieronder groep I genoemd) in zichzelf vergeleken met de tumoren die zich elders in het skelet bevinden (hieronder groep II genoemd). Dit is gedaan om te onderzoeken of de tumoren biologisch verschillend zijn, of dat de locatie van deze tumoren in vinger en tenen de oorzaak is van hun goede prognose. 
Wat betreft eiwitexpressie (hoofdstuk 5) zijn vanwege de overeenkomsten in de histologie de chondrosarcomen in groep I vergeleken met graad II chondrosarcomas uit groep II. In totaal zijn 64 enchondromen (waarvan 21 behoren tot groep I) en 89 chondrosarcomen (waarvan 17 behoren tot groep I) onderzocht op verschillen in de IHH en PTHLH signaal transductie regelkring. Er zijn geen significante verschillen gevonden tussen de chondrosarcomen van groep I en de graad II chondrosarcomen uit groep II. Er was echter wel een kleine groep van chondrosarcomen gelokaliseerd in de botten van vinger en tenen (groep I) die verminderde expressie toonden van het eiwit PTHLH. De BCL2 en PTHR1
eiwitexpressie van enchondromen uit groep I waren hoger wanneer deze werden vergeleken met enchondromen uit groep II (hoofdstuk 5). 
RNA expressie analyse is met behulp van cDNA microarray analyse (hoofdstuk 6) uitgevoerd op 3 enchondromen van groep I en 19 chondrosarcomen uit groep II. Over het algemeen bevonden de expressie niveaus van de enchondromen uit groep I zich tussen die van de graad I en graad III chondrosarcomen.
In hoofdstuk 7 is aangetoond dat het aantal genomische veranderingen in enchondromen uit groep I beperkt is, zowel in grootte als in aantal. 
De verminderde expressie van de PTHLH die enkele van de tumoren uit groep I vertonen zou dus een oorzaak kunnen zijn van hun relatief gunstige prognose. Een aanwijzing dat er mogelijk een biologisch verschil ten grondslag aan het verschillend klinisch gedrag zou kunnen liggen is de geringe hoeveelheid genomische veranderingen.
IV.b. Tumoren in de context van enchondromatose Enchondromatose wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van meerdere enchondromen op verschillende locaties in één patiënt. Gedurende dit onderzoek is in hoofdstuk 4-7 onderzocht
of de tumoren van patiënten met enchondromatose verschillende moleculaire kenmerken hebben ten opzichte van solitaire tumoren. Deze resultaten zouden mogelijk aanwijzingen kunnen geven die leiden tot het vinden van de oorzaak van dit syndroom. Daarnaast zou er mogelijk een verklaring gevonden kunnen worden voor feit dat de histologie een slechte voorspeller is voor gedrag in patiënten met enchondromatose. 
In hoofdstuk 4 is gekeken naar de aanwezigheid van een eerder in de literatuur beschreven mutatie in het gen PTHR1 (c.448C>T, p.R150C). Hiervoor zijn enchondromen en chondrosarcomen van 31 patiënten uit drie verschillende Europese landen verzameld die gediagnosticeerd waren met enchondromatose. De hierboven genoemde mutatie is niet gevonden in 31 (100%) van de geteste patiënten, noch is er enige aanwijzing gevonden voor aanwezigheid van een andere mutatie in dit gen. In hoofdstuk 7 is de aanwezigheid van grote genomische veranderingen (>~1 Mb) onderzocht in 4 tumoren van patiënten met M. Ollier. Hoewel er in de individuele tumoren wel veranderingen zijn gevonden, waren geen
van deze aanwezig in alle onderzochte tumoren, noch waren er specifieke afwijkingen in tumoren in de context van M. Ollier. 
Met behulp van de onderzoeken zoals beschreven in de hoofdstukken 4 en 5 zijn er geen aanwijzing gevonden dat veranderingen in de PTHLH signaaltransductie regelkring, of specifiek veranderingen in het PTHR1 gen, verantwoordelijk zouden zijn voor het ontstaan van enchondromatose. RNA expressie studies (hoofdstuk 6) lieten zien dat er alleen zeer kleine (niet significante) verschillen zijn tussen graad II tumoren van patiënten met M. Ollier en solitaire graad II tumoren, hoewel sommige van deze verschillen mogelijk wel van betekenis zouden kunnen zijn als de groepen groter zouden worden gemaakt. 
Uiteindelijk is er in geen van de uitgevoerde experimenten een verschil gevonden tussen enchondromatose gerelateerde tumoren en solitaire tumoren, wat erop wijst dat in beide gevallen dezelfde regelkringen zijn aangedaan. 
De oorzaak van enchondromatose is nog altijd niet bekend. Het syndroom is niet erfelijk en het feit dat in sommige patiënten alleen bepaalde gedeeltes van het lichaam zijn aangedaan (bijvoorbeeld alleen de rechterkant) suggereert dat de oorzaak mogelijk in de vroeg embryonale ontwikkeling ligt. In dat geval zou in een vroeg stadium één cel kunnen veranderen, bijvoorbeeld een mutatie. Deze cel zou potentieel kunnen uitgroeien tot cellen die deel uitmaken van een bepaald deel van het lichaam wat ook wel mosaicisme genoemd wordt. Dit fenomeen wordt waargenomen bij andere aandoeningen zoals het McCune-Albright syndroom. De veranderde cellen zouden kwetsbaarder zijn voor een volgende verandering die zou kunnen leiden tot de ontwikkeling van enchondromen (Figuur 8.2). Nader onderzoek is nodig om deze hypothese te testen. De mutaties in het gen verantwoordelijk voor het McCune-Albright syndroom werden ontdekt door het zoeken naar klinische en biochemische overeenkomsten tussen dit syndroom en erfelijke aandoeningen. Hierbij kwam men uit bij Albright osteodystrophie, waarvan de veroorzakende mutaties reeds bekend waren. In beide aandoeningen bleek een en hetzelfde gen aangedaan te zijn namelijk GNAS1.
Helaas zal het moeilijk zijn om op dezelfde manier te werk te gaan in het geval van
enchondromatose. Hoewel er wel overeenkomsten zijn met erfelijke aandoeningen, zijn deze syndromen nog zeldzamer dan M. Ollier of het Maffucci syndroom. Daarom is het waarschijnlijker dat de oorzaak zal worden gevonden aan de hand van uitgebreide studies naar RNA en eiwit expressie niveaus gebruikmakend van een grotere hoeveelheid M. Ollier gerelateerde tumoren dan in dit proefschrift gebruikt zijn.

V. Conclusies en samenvatting
Het doel van dit proefschrift was het onderzoeken van de moleculaire processen betrokken bij de ontwikkeling en progressie van enchondromen en conventionele centraal-gelegen chondrosarcomen, inclusief de subgroepen van M. Ollier gerelateerde tumoren en die gelokaliseerd in de botten van vingers en tenen.
Hoewel er duidelijk klinische verschillen te vinden zijn tussen deze subgroepen (M. Ollier gerelateerd, tumoren gelokaliseerd in de botten van vinger en tenen en de solitaire tumoren elders) zijn er geen duidelijke verschillen op moleculair niveau. Tumoren geassocieerd met M. Ollier zijn op moleculair niveau niet significant verschillend van solitaire tumoren. In het geval van de tumoren van vingers en tenen vertoonde een gedeelte van de tumoren een verminderde PTHLH eiwitexpressie.
Ons doel was het verder verduidelijken van een stapsgewijs model voor tumorvorming en het identificeren van diagnostische en progressie gerelateerde moleculaire kenmerken. Er is een model voor tumorvorming gemaakt, waarin de veranderingen aangaande maligne transformatie, progressie en die gerelateerd aan slechtere prognoses, zoals gevonden in dit proefschrift zijn verwerkt (Figuur 8.1). Gerelateerd met transformatie is een verhoogde eiwitexpressie van JUNB gevonden in laaggradige chondrosarcomen ten opzichte van enchondromen. Een slechtere prognose (en hogere histologische graad) gaat gepaard met hogere expressie niveaus van eiwitten in de PTHLH regelkring, alsmede hogere expressie
van glycolyse geassocieerde genen gecombineerd met verlaagde expressie van oxidatieve fosforylering gerelateerde genen. 
De analyse van de genomische veranderingen gecombineerd met de uitgebreide RNA niveau analyse leidde tot de identificatie van de kandidaat genen RPS6 en CDK4. Deze genen maken deel uit van verder onderzoek, om hun rol in de pathogenese van enchondromen en conventionele centrale chondrosarcomen te verduidelijken.

Summary:  

I. Expression analysis of central chondrosarcoma
The mechanism behind malignant transformation of enchondromas into chondrosarcomas is not known, and as yet no molecular markers have been identified for the difficult histological differential diagnosis of enchondroma versus low-grade central chondrosarcoma. The histological grading system of the chondrosarcomas is hampered by interobserver variations in evaluation of the different histological features. Chondrosarcomas are one of the rare mesenchymal tumors that upon recurrence may show progression in grade. Thus investigation
of the expression patterns characterizing different grades may give an insight in the
mechanisms of this process and may also shed light on genetic pathways involved in metastasis and disease-related death.
I.a. Specific (hypothesis driven) expression analysis
RNA and protein expression was investigated in the chapters 3 (CDKN2A), chapter 5 (IHH and PTHLH signaling) and chapter 6 (JUNB).
I.a.i. CDKN2A
The gene coding for the p16 protein is located in a region that is deleted in a subset of central chondrosarcomas. Combined analysis of genetics and protein expression revealed loss of this genomic region and loss of protein expression in mainly high-grade chondrosarcomas (chapter 3). However, there was no correlation between loss of protein expression, LOH and or promotor methylation, suggesting an alternative manner of downregulation of gene expression.
I.a.ii. JUNB
JUNB was one of the genes that showed a small, but non-significant, difference comparing three Ollier disease-related grade II chondrosarcomas with four solitary grade II chondrosarcomas using a large scale gene expression analysis (chapter 6). This protein is a subunit of the AP-1 transcription factor family, and is implicated in chondrogenic differentiation. JunB knock-out mice show reduced proliferation of growth plate chondrocytes and osteoblasts. Comparing the protein expression of this gene in a larger group of Ollier disease-related and solitary enchondromas and central chondrosarcomas revealed that no difference was present between these two groups. However, comparing enchondromas and low-grade chondrosarcomas, a significant increase of protein expression was found in chondrosarcomas, suggesting the possible use of JUNB as a diagnostic marker in the distinction between enchondromas and low-grade chondrosarcomas.
I.a.iii. IHH and PTHLH signaling
In chapter 1 and 2 it was discussed that the IHH/PTHLH signaling plays an important role in the growth and differentiation of the normal growth plate. In hereditary osteochondromas these signaling pathways are affected by mutations in the EXT1 or EXT2 gene. The expression of molecules involved in the IHH/PTHLH signaling in enchondromas and central chondrosarcomas was investigated in chapter 5.
Proteins of both signaling pathways were studied by immunohistochemical analysis (PTHLH signaling: PTHLH, PTHR1, BCL2, p21, cyclin D1 and cyclin E) or RNA expression (IHH signaling: IHH, PTCH, SMOH and GLI2). The data show that IHH signaling is absent in enchondromas and central chondrosarcomas, while PTHLH signaling is active. There was no difference in expression of any of the molecules between 35 enchondromas and 26 grade I central chondrosarcomas, indicating that PTHLH signaling is not important in malignant transformation of enchondroma. Higher expression of PTHR1 and BCL2 at the immunohistochemical level was associated with increasing histological grade in chondrosarcoma, suggesting involvement in tumor progression. 
I.b. Large scale gene expression analysis
In chapter 6 RNA expression levels of enchondromas and central chondrosarcomas was studied genome wide, by cDNA micro array analysis. Possible changes underlying malignant transformation could not be investigated, due to the fact that RNA isolation of non-phalangeal enchondromas did not yield enough RNA for expression studies. Expression patterns related to progression were investigated by comparing grade I and grade III central chondrosarcomas.
Apart from already known/suspected alterations, such as downregulation of extracellular matrix genes, other processes were significantly different between these two groups. 
One of these was downregulation of the oxidative phosphorylation, and upregulation of the glycolysis in grade III chondrosarcomas. Both processes are involved in the energy supply of the cell. Increased glycolysis is described in several cancer types, and even suggested to be a hallmark of invasive tumors. The upregulation of anaerobic glycolysis in the hypoxic (i.e. low-grade) situation is hypothesized to give a growth advantage. With increased vascularization (i.e. high-grade), more oxygen is available to the cells and the use of the glycolytic pathway is not downregulated, but most likely changed from anaerobic to aerobic. The downregulation of the OXPHOS may result from the increased glycolysis and can be reversed in some cases. Other explanations for the upregulation of glycolysis and downregulation of the OXPHOS could be the need for products produced in the glycolysis, the inability to store glucose in the cancer cells, failure of the OXPHOS complex, or to decrease the amount of Reactive Oxygen Species, that are capable to induce DNA damage.

II. Genetic aberrations of central chondrosarcoma
So far few specific genomic alterations have been found specific for enchondromas and conventional central chondrosarcomas (9p21, 12q). In previous studies often both conventional central and secondary peripheral chondrosarcomas were analyzed as one group, obscuring possible specific aberrations in either subgroup.
In chapter 3, based on previous studies, the location of loss on 9p21, which seems to be specific for central chondrosarcomas was investigated further. In this area one of the genes was the tumor suppressor CDKN2A, which is involved in cell cycle regulation and is a target for deletion in many other types of cancers. Loss of heterozygosity (LOH ) of four markers, surrounding the CDKN2A/INK4a locus, was found in 15 out of 39 chondrosarcomas (38%). Screening for mutations in the genes CDKN2A and p14ARF, by SSCP analysis, did not reveal any mutations in 47 cases in either gene. Our results suggest that a locus other than the CDKN2A/INK4a must be the target of LOH at 9p21.
In chapter 7 we investigated genome wide, using array-CGH, the genomicaberrations in 21 primary tumor samples, three enchondromas, seven grade I, seven grade II and four grade III chondrosarcomas. We observed an increase in the number and size of the aberrations, correlating with increased histological grade. In case of enchondromas (of the phalanx) and grade I chondrosarcomas generally the number of aberrations was limited and the size of the amplifications/deletions was small, although for instance in one enchondroma loss of complete chromosome 6 was observed. In the high-grade tumors substantially more alterations were observed, often in a seeming random manor, as if genomic instability is taking place.
None of the alterations were present in all tumors, but recurrent alterations were observed. By applying a cut-off of minimally affected in 5 or more tumors in the same manor (all lost, or all gained) and a minimum of 3 adjacent clones, we identified 22 regions, ranging from 0.55 till 113 Mb. Some of these regions were reported previously, while others were not. Interestingly, some chromosomes contained multiple regions, like chromosomes 7 (7p12.3- p15.3, 7p11.2-q11.23, 7q36.1-q36.3), 12 (12p13, 12p11.21-p11.23 and 12q13) and 20 (20q11.21, 20q12, 20q13.33). Analysis of the data revealed that some chromosomes and
regions seemed specific for either progression and/or prognosis. Loss of chromosomes 6, 10 and gain of 12q12 was correlated with increasing grade and loss of chromosome 10 (10pter - 10q25.3), 4q13, 4q34.3 and gain of 9q34 was correlated with adverse prognosis.
In general, amplifications of chromosome 12 are reported frequently in tumors. Especially in several sarcoma types, such as osteosarcomas and liposarcomas, amplification of 12q13- 15 is a frequent finding. This region contains amongst others the genes CDK4, MDM2, SAS and genes coding for high mobility group (HMG) proteins. Amplification of the short arm of chromosome 12 is seen in other cancer types, such as testicular germ-cell tumors, distal bile duct carcinoma and pancreatic carcinoma. In both testicular germ-cell tumors and pancreatic carcinomas specifically the region 12p11 is also implicated. Gain of 12p is thought to be related to malignant progression.
Combining the results from the cDNA expression array (chapter 6) and array-CGH (chapter 7), the RNA expression levels of genes located in the recurrent regions of amplification or deletion were analyzed (chapter 7). We found that for two genes on our cDNA array the expression matched the changes seen in the BAC array. CDK4, located on 12q13, was higher expressed in tumors containing an amplification of this region. Of the second gene, RPS6 (ribosomal protein S6), located in the deleted region 9p21.3-p24.1, low expression levels significantly correlated with the deletion. These data suggest that the mentioned genes may
be the targets for the amplification and deletion found.

III. Multi-step model for tumorigenesis
Combining all data, a multi step model for the development of central cartilaginous tumors can be proposed (Figure 8.1). 
With the malignant transformation of enchondroma towards chondrosarcoma upregulation of the protein JUNB is observed (chapter 6). The progression of low- to high-grade chondrosarcomas shows the upregulation of the glycolysis, combined with the downregulation
of the oxidative phosphorylation (chapter 6). Increased protein expression of PTHR1 and BCL2 is also observed with increasing histological grade (chapter 5), whereas the protein expression of p16 decreases (chapter 3). On the genomic level, no specific alterations were observed in enchondromas and low-grade central chondrosarcomas. The transition of lowto high-grade central chondrosarcomas is characterized by loss of chromosome 6, 10 and gain of chromosomal region 12q12, although loss of chromosome 6 was also observed in
one enchondroma. In addition, the number of losses and gains as well as the size of these aberrations increased in high-grade tumors, possibly as a result of genomic instability (chapter 7). Correlating with adverse outcome are the loss of 4q13, 4q34, and 10pter-10q25 and gain of 9q34 (chapter 7).

IV. Conventional central chondrosarcoma subtyping
Within the conventional type of central chondrosarcomas, based upon clinical data, different subtypes can be distinguished. Chondrosarcomas located in the phalanx display a more indolent clinical behavior compared to those with similar histological features located in other regions of the skeleton. Also in patients with enchondromatosis, characterized by multiple central cartilaginous lesions, criteria are different, as a consequence of the different clinical features, compared to those of solitary tumors.
IV.a. Phalangeal lesions
In chapters 5 and 6, RNA and protein expression levels of tumors located in the phalanx were compared to enchondromas and chondrosarcomas located elsewhere to elucidate whether these tumors are biologically different from those located at other regions, or whether the location is causative for their good prognosis.
For immunohistochemical analysis (chapter 5) the chondrosarcomas located in the phalanx were compared to chondrosarcomas grade II located elsewhere, based upon similarities in their histology. In total for 64 enchondromas (21 located in phalanx) and 89 chondrosarcomas 17 located in phalanx) the IHH and PTHLH signaling was investigated. Overall statistical analysis revealed no significant differences between chondrosarcomas located in the phalanx and chondrosarcoma grade II located elsewhere in the skeleton. However, a small subset of phalangeal chondrosarcomas demonstrated downregulation of PTHLH.
RNA expression analysis, by cDNA microarray analysis (chapter 6), was performed on three phalangeal enchondromas and 19 chondrosarcomas elsewhere of different grades. Overall the expression levels of the phalangeal enchondromas were found to be intermediate to those of grade I and III chondrosarcomas. Moreover, the immunohistochemical comparison of phalangeal enchondromas with enchondromas located elsewhere revealed increased
expression of BCL2 and a trend for increased PTHR1 expression in the phalangeal
enchondromas. 
The number of genomic aberrations (chapter 7) in phalangeal enchondromas is small, both in size and number. Unfortunately, phalangeal chondrosarcomas and enchondromas located elsewhere could not be investigated, due to the lack of fresh frozen material and fragmentation of the DNA in parrafin blocks due to decalcification, thus a comparison at the genomic level could not be made.
Combining these results, the better prognosis of phalangeal chondrosarcomas (i.e. low risk of metastasis) could be partly due to the downregulation of the PTHLH signaling. Downregulation of PTHLH and BCL2 is also observed in osteochondromas, the benign counterparts of secondary peripheral chondrosarcomas. It therefore may be a representation of benign behavior. However, most enchondromas display active PTHLH signaling. Also the smaller number of genomic alterations in phalangeal enchondromas, as compared to chondrosarcomas grade I-II with similar histological features, may partly cause the better prognosis. However, studies of genomic aberrations in phalangeal chondrosarcomas would be required to test this hypothesis. In contrast, RNA expression levels of phalangeal enchondromas suggest that these tumors have malignant features, comparable to grade I-II chondrosarcomas, with which these tumors share several histological features. However, no data were available for non-phalangeal enchondromas, and therefore we cannot exclude that these tumors have overall expression levels comparable to the grade I-II chondrosarcomas.
Together these results support both the theory that the more indolent clinical behavior has a molecular origin reflecting a different biological make up (lower PTHLH expression, low number of genomic aberrations), as well as the theory that the location is the most important cause for the better prognosis (RNA expression levels of phalangeal enchondromas are in line with of those of chondrosarcomas grade II located elsewhere).
IV.b. Enchondromatosis
Enchondromatosis is defined by the presence of multiple enchondromas at different sites. We investigated whether tumors in this context have different molecular features compared to solitary tumors. These results then may give clues to the underlying molecular defect and/ or explain the less malignant behavior of these tumors in patients with enchondromatosis. In the chapters 4-7 tumors of patients with enchondromatosis (Ollier disease, Maffucci syndrome) were investigated. In chapter 4 we looked for the presence of a previously reported
mutation in PTHR1 (c.448C>T, p.R150C). We collected enchondromas and chondrosarcomas from 31 enchondromatosis patients from three different European countries. Screening for this specific mutation in 26 patients did not reveal the presence of it, nor did direct sequencing of all coding regions of PTHR1 result in any other mutation. In chapter 7 we investigated the presence of large genomic aberrations (>~1Mb) in four tumors of patients with Ollier disease. Although individual tumors showed aberrations, none of these were present in all of
the investigated Ollier disease-related tumors and none were specific for Ollier disease. With the studies in chapters 4 and 5 we excluded that differences in the PTHLH signaling, and specifically alterations of the PTHR1 gene were causative for enchondromatosis. RNA expression studies (chapter 6) revealed only small non-significant differences comparing three Ollier disease related grade II chondrosarcomas to four solitary grade II chondrosarcomas, although some genes listed in may become significant, if tested on larger groups
So, in all non of our studies significant differences were found between enchondromatosisrelated tumors and solitary tumors, suggesting that in both occasions the same pathways are affected.
The cause of enchondromatosis is still unknown. The syndrome is not hereditary and the fact that in some patients only certain parts of the body are affected (for instance only right side, upper body, etc), suggest that the cause of these syndromes lies in early development. In that case, in the early stages a single cell could be affected, for instance by a mutation. This cell could than potentially grow out to cells populating one part of the body (mosaicism, reported for McCune-Albright syndrome, OMIM #174800). Subsequently these cells could be more vulnerable for a second hit which would be required for the development of enchondromas (Figure 8.2). Further research will be required to test this hypothesis. To identify the cause of enchondromatosis it could be investigated as was done for McCune-Albright syndrome. The gene (GNAS1) causing this was identified by searching for an hereditary syndrome, displaying similar biochemical and clinical features. This was the case for Albright hereditary osteodystrophy, for which causative mutations had already been identified. Unfortunately, although in case of Enchondromatosis some hereditary syndromes are known, but these
have an even lower incidence than Ollier disease or Maffucci syndrome. Therefore, clues of what is causing enchondromatosis are most likely to be found by genome wide analysis of RNA or protein expression of a larger group of Ollier disease-related tumors. 

V. Concluding remarks and directions for future research
The purpose of this thesis was to investigate the molecular processes involved in development and progression of enchondromas and conventional central chondrosarcomas, including the subgroups of those arising in patients with Ollier disease and in the phalanx. Within these groups, though clearly clinical differences are observed between the three different subgroups (Ollier disease–related, phalangeal localization and solitary nonphalangeal tumors), no clear molecular differences are observed. Ollier-disease-related tumors showed no significant differences from solitary tumors. Phalangeal lesions showed a decrease of PTHLH expression in only a subset of the phalangeal chondrosarcomas. Our aim was to further elucidate the multi-step model and identify diagnostic and prognostic
markers.
We constructed a multi-step model, showing alterations as described in this thesis regarding malignant transformation, progression and correlation with adverse prognosis. We identified protein expression of JUNB as a candidate diagnostic tool, showing increased expression in (low-grade) chondrosarcomas compared to enchondromas. Related with prognosis we found upregulation of PTHLH signaling in high-grade chondrosarcomas and upregulation of glycolysis-associated genes combined with downregulation of genes involved in the oxidative phosphorylation in high-grade chondrosarcomas.
Our genome wide analysis at DNA and RNA level pointed to the candidate genes RPS6 and CDK4, which are the subject of continuing research, to unravel their role in the pathogenesis of enchondromas and conventional central chondrosarcomas.