Promoties Geneeskunde

Korte samenvatting:

Dendritische cellen (DCs) zijn professionele antigen-presenterende cellen die een essentiële rol vervullen in de immunologische afweer, vooral in het activeren van T-cellen. Pauline Verdijk onderzocht zowel de rijping van DCs als de migratie van geactiveerde T-cellen. Cofiline bleek belangrijk voor de vormveranderingen van DCs; Langerine bleek bepalend voor de vorming van Birbeck-granula in Langerhanscellen. 
Geactiveerde T-cellen reageren via receptor CXCR3 vooral op in de huid geproduceerde chemokine CXCL11 en hebben calcium nodig om hun richting te bepalen. De CXCR3 antagonist VUF5834 lijkt interessant voor de ontwikkeling van een middel tegen ziektebeelden die ontstaan door overmatige infiltratie van geactiveerde, CXCR3-dragende T-cellen. 

Samenvatting:

Inleiding
Het lichaam wordt op verschillende manieren beschermd tegen infecties met ziekteverwekkers (pathogenen) zoals virussen, bacteriën en schimmels. Ten eerste belemmeren fysieke barrieres het binnentreden van pathogenen. Een voorbeeld hiervan vormt de huid; een haast ondoordringbare schild dat vocht en warmte van het lichaam binnenhoudt en vuil en pathogenen buiten. Als er toch op een of andere manier indringers binnen weten te komen, komt het immuunsysteem in actie. Het immuunsysteem is een zeer complexe organisatie, die door het hele lichaam heen vertegenwoordigd is. Hieraan doen ook weefselcellen mee (bijv. keratinocyten in de huid) door de productie van eiwitten die een antibacteriële of een signaalwerking hebben. De signaalstoffen activeren op hun beurt cellen die de bestrijding van infecties als hoofdfunctie hebben, zoals macrofagen, granulocyten, “natural killer” (NK) cellen en dendritische cellen. Deze reacties zijn niet-specifiek en vallen onder de eerste lijn van de verdediging, de aangeboren immuniteit. De tweede lijn wordt gevormd door de verworven immuniteit en bestaat uit T en B cellen. Deze cellen herkennen de pathogeen juist heel specifiek. Voor elke ziekteverwekker wordt een aparte set van cellen actief, die alleen reageert op die specifieke indringer. Een andere belangrijke eigenschap van de verworven immuniteit is dat het een geheugen ontwikkelt. Als het lichaam voor de tweede (of derde enz.) keer geïnfecteerd wordt met dezelfde bacterie of hetzelfde virus, zal het immuunsysteem veel sneller en effectiever kunnen reageren, waardoor het lichaam beter beschermd is.

Zoals gezegd zijn de T- en B cellen onderdeel van de verworven immuniteit. B cellen zijn verantwoordelijk voor de productie van antilichamen (antistoffen) tegen pathogenen. Antilichamen binden aan de ziekteverwekker, zodat deze herkenbaar wordt voor andere componenten van het immuunsysteem en opgeruimd kan worden. T cellen zijn er in verschillende soorten: ‘killer’ T cellen, die geïnfecteerde cellen kunnen herkennen en onschadelijk maken, helper T cellen, die o.a. de activatie van killer T cellen en B cellen helpen en het geheugen stimuleren en regulatoire T cellen, die ongewenste immuunreacties kunnen onderdrukken.

Dendritische cellen
Een belangrijke schakel tussen het eerste en het tweede leger is de dendritische cel (DC). Dendritische cellen hebben namelijk als hoofdtaak het activeren van naïeve T cellen (T cellen die nog niet eerder in aanraking zijn geweest met deeltjes van pathogenen [antigenen]) in geval van een infectie. In weefsels die een barriere vormen tussen het lichaam en de buitenwereld, zoals de huid, de longen en de darmen, bevinden zich dendritische cellen. De eigenschappen van de DCs hangen af van het stadium waarin ze verkeren. In de weefsels zijn de DCs onrijp en zijn ze heel goed in het opnemen van alles wat in hun omgeving komt (antigenen). De opgenomen antigenen worden door de DCs in specifieke organellen (=orgaan van een cel) verwerkt om in kleine stukjes gepresenteerd te worden aan T cellen. Het presenteren van antigenen aan T cellen is een eigenschap van rijpe DCs. De rijping (maturatie) van DCs vindt plaats in reactie op een infectie. Tijdens de maturatie neemt de capaciteit om antigen op te nemen af en neemt de presentatie van antigenen sterk toe met als doel de activatie van specifieke T cellen. Tegelijkertijd migreren de DCs vanuit het weefsel via de lymfevaten naar de dichtstbijzijnde lymfeklier. Ook verandert het uiterlijk van de cel. Onrijpe DCs hebben een vrij rond uiterlijk, maar na maturatie vertonen ze op uitgebreide schaal dunne en langwerpige uitstulpingen als een soort sluier. Dit uiterlijk is nodig om zoveel mogelijk contact te kunnen maken met T cellen.

De lymfeklier is de ontmoetingsplaats voor dendritische cellen, T- en B cellen. Hier komen de DCs in aanraking met een heleboel T cellen. Elke T cell heeft echter een specifieke en heel eigen T cel receptor, waarmee hij unieke stukjes eiwit kan herkennen. Alleen de T cellen die een stukje herkennen dat gepresenteerd wordt door de DCs, worden geactiveerd. Een deel van de geactiveerde cellen zal achterblijven in de lymfklier om zich te ontwikkelen tot een geheugencel, maar het overgrote deel zal de klier verlaten en op zoek gaan naar de plaats van de infectie.

Migratie en chemokines
Het doel waar immuuncellen naartoe migreren wordt gereguleerd door eiwitten op het oppervlak van de immuuncellen en door eiwitten die daaraan binden en die gemaakt worden door weefselcellen. Een belangrijk onderdeel daarvan is het chemokine-receptor systeem. Chemokines zijn kleine eiwitten die als een soort lokstof dienen om bepaalde cellen aan te trekken. Welke cellen aangetrokken worden hangt af van het soort receptoren die de cel op zijn oppervlak heeft. Cellen die de juiste receptor hebben zullen in de richting van de hoogste concentratie van dat chemokine migreren. Op die manier kunnen cellen heel gericht naar de plaats van infectie migreren omdat daar de juiste chemokines gemaakt worden.

Dit proefschrift
In de hoofdstukken 2 tot en met 6 van dit proefschrift worden verschillende aspecten van verworven immuniteit belicht. Als eerste wordt de dendritische cel bestudeerd die zo’n belangrijke rol speelt bij de activatie van T cellen. In hoofdstuk 2 worden de verschillen tussen de maturatiestadia van de DCs bestudeerd, terwijl hoofdstuk 3 zich richt op een speciale dendritische cel, namelijk de Langerhans cel. Als tweede wordt aandacht geschonken aan de migratie van T cellen en met name hoe chemokines via een bepaalde receptor inwerken op de geactiveerde T cel. In de hoofdstukken 4 en 5 wordt de manier waarop de T cel op chemokines reageert onderzocht. In hoofdstuk 6 wordt onderzocht of de werking van chemokines op de bijbehorende chemokinereceptor op T cellen geblokkeerd kan worden. Dit kan interessant zijn voor de ontwikkeling van nieuwe behandelmethodes voor een breed scala aan immuunziektes, waarbij een overmatige activiteit van geactiveerde T cellen aangetroffen wordt. Hieronder volgt een korte beschrijving van elk hoofdstuk.

Dendritische cellen

Hoofdstuk 2
In hoofdstuk 2 wordt de maturatie van DCs nader onderzocht. Er is al veel bekend over hoe een DC een T cel activeert, maar sommige aspecten zijn nog onderbelicht. In hoofdstuk 2 is gezocht naar verschillen tussen onrijpe en rijpe DCs in de eiwiten de ze aanmaken. Het aantal verschillende eiwitten dat een cel aanmaakt (eiwitexpressie) wordt geschat op rond de 6000. Eiwitten zijn opgebouwd uit aminozuren, waarvan er 20 verschillende bestaan, en bevatten soms ook suikers. De volgorde van de aminozuren bepalen de eigenschappen van het eiwit. Een groot aantal eiwitten kan in verschillende vormen voorkomen. Er kunnen bijvoorbeeld groepen, zoals fosfaat, aangehangen of verwijderd worden die de werking van het eiwit beinvloeden. Door de vorm van een eiwit te veranderen kunnen functies van een cel gereguleerd worden. Al deze aanpassingen leveren een een enorme variatie op. Om verschillen te kunnen vinden in het eiwitrepertoire in verschillende celstadia, moeten de eiwitten van elkaar gescheiden worden. Dit is mogelijk door gelelectroforese. Met deze methode kunnen eiwitten gescheiden worden op basis van hun eigenschappen. Om een zo groot mogelijke scheiding te krijgen, werden eiwitten eerst op basis van hun grootte en vervolgens op basis van hun zuurtegraad (pH) gescheiden. Daarna werden de eiwitten aangetoond met een zilverkleuring, waardoor een 2-dimensionaal patroon ontstaat. Van de eiwitten van zowel onrijpe als rijpe DCs zijn twee-dimensionele plaatjes gemaakt, die vervolgens met elkaar vergeleken werden. Hieruit kwam naar voren dat een van de eiwitten die verschilt tussen onrijpe en rijpe DCs Cofiline is. Dit eiwit was in beide celstadia in evengrote hoeveelheden aanwezig, echter in een andere vorm. Dit verschil in vorm zorgt ervoor dat in de rijpe cel veel meer cofiline actief is dan in de onrijpe cel. Cofiline speelt een belangrijke rol in het skelet van een cel en daarmee in de vorm die een cel aanneemt. De verhoogde cofiline activiteit in rijpe DCs is waarschijnlijk belangrijk voor de verandering in vorm die w

Hoofdstuk 3
Een speciaal type DC is de Langerhans cel. De Langerhans cel (LC) bevindt zich in de opperhuid en strekt lange tentakels uit tussen de huidcellen. Hiermee kan de LC de omgeving in de gaten houden en controlen op de invasie van ziekteverwekkers. Wat LCs onderscheidt van alle andere DCs is een organel (orgaan in een cel) dat de Birbeck granule genoemd wordt. De functie van dit organel is nog vrij onbekend, maar heeft mogelijk te maken met de presentatie van antigenen. Tien jaar geleden was bij toeval bij iemand vastgesteld dat deze persoon geen Birbeck granula had in zijn LCs. Deze indexpersoon was volkomen gezond en er konden geen afwijkingen gevonden worden in testen van verschillende immuunreacties. Onlangs is gebleken dat een bepaald eiwit dat alleen in Langerhans cellen voorkomt, genaamd Langerine, verantwoordelijk is voor de vorming van deze granula. Als dit eiwit kunstmatig in andere cellen die nooit Birbeck granula maken wordt gebracht, vertonen deze cellen ook Birbeck granula. Wij hebben onderzocht of er misschien een foutje zit in het DNA van de indexpersoon dat codeert voor Langerine, dat de afwezigheid van de Birbeck granula veroorzaakt. Wij hebben inderdaad een mutatie gevonden in het Langerine DNA, wat resulteerde in verandering van één aminozuur in het eiwit. Deze mutatie zat op een plaats in het eiwit met een belangrijke functie en is mogelijk de oorzaak van de afwezigheid van Birbeck granula in de indexpersoon. We hebben gecontroleerd of deze mutatie ook de aanmaak van Birbeck granula voorkomt. Daarvoor hebben we het DNA met en zonder de mutatie in cellen gezet en naar het effect gekeken. In cellen met het normale Langerine DNA ontstonden Birbeck granula. Echter in cellen met Langerine DNA met een mutatie gebeurde dat niet. Dit wijst erop dat deze mutatie inderdaad effect heeft op de vorming van Birbeck granula.

T cel migratie

Zoals boven vermeld, zijn chemokines kleine eiwitten die cellen kunnen aantrekken. De chemokines kunnen binden aan receptoren op het oppervlak van een cel. In de cel wordt daarop een signaal doorgegeven (signaaltransductie), dat verteld dat de cel zich moet gaan bewegen in de richting van de hoogste concentratie van dat chemokine. Er zijn veel verschillende receptoren en nog veel meer verschillende chemokines. Door middel van het selectief maken van chemokine receptoren kunnen immuuncellen zoals T cellen specifiek geleid worden naar verschillende weefsels en zelfs nog specifieker, naar de plaats van de ontsteking. In de huid bijvoorbeeld worden onder invloed van bepaalde signaalstoffen de liganden (stoffen die aan een receptor binden en die activeren) van chemokinereceptor CXCR3 geproduceerd: CXCL9, CXCL10 en CXCL11. De receptor CXCR3 komt op een groot deel van alle geactiveerde T cellen tot expressie. Deze expressie van CXCR3 op T cellen en CXCL9-11 in de huid speelt waarschijnlijk een belangrijke rol bij een aantal huidziektes. Wanneer je in wilt grijpen op een bepaald mechanisme is het van belang alle betrokken processen en hun functie te kennen. In hoofdstukken 4 en 5 wordt daarom de signaaltransductie van CXCR3 in de T cel bestudeerd. In hoofdstuk 6 wordt vervolgens gezocht naar een stofje dat de binding van de chemokines CXCL9-11 aan CXCR3 kan blokkeren. Dit kan uiteindelijk leiden tot de ontwikkeling van een medicijn dat ziekteverschijnselen kan remmen in een groot aantal aandoeningen die gekenmerkt worden door een overmatige infiltratie van geactiveerde CXCR3-positieve T cellen.

Hoofdstuk 4 en 5
Wanneer een signaalstof als een chemokine bindt aan een cel, moet de cel deze informatie omzetten in actie. Dit proces wordt gereguleerd door een een verzameling eiwitten en andere moleculen, die op een of andere manier geactiveerd of juist geïnactiveerd moeten worden. Wanneer het chemokine aan zijn receptor op het oppervlak van de cel bindt, vindt er in de cel een cascade van reacties plaats die ervoor zorgen dat de benodigde eiwitten en moleculen in actie komen. De signalen hiervoor kunnen op heel veel manieren doorgegeven worden. Welke eiwitten en moleculen daarbij betrokken zijn, is afhankelijk van de receptor en het celtype. In hoofdstuk 4 en 5 wordt onderzocht welke signaal routes van belang zijn voor migratie van T cellen na stimulatie van de CXCR3-receptor.

In hoofdstuk 4 worden de betrokkenheid van verschillende eiwitten uitgetest door het toedienen van remmers. Hierbij werd gebruik gemaakt van zowel humane T cellen geïsoleerd uit bloed met de CXCR3-receptor op hun oppervlak, als cellijnen waar kunstmatig de CXCR3-receptor ingezet is. Uit de experimenten bleek dat het eiwit phospholipase C een cruciale rol heeft in de activatie van T celmigratie, maar dat de andere geteste eiwitten niet van belang zijn voor dit proces. Tevens werd aangetoond dat activatie van migratie niet in alle cellen en niet met alle chemokinereceptoren op dezelfde manier gaat. Een van de eiwitten, PI3K (fosfatidylinositol-3-kinase), waarvan door veel onderzoekers beschreven wordt dat het essentieel is voor migratie van cellen, bleek niet betrokken te zijn bij de migratie van T cellen na stimulatie van CXCR3. Ook werd bevestigd dat van de drie liganden het chemokine CXCL11 de beste activator van T cellen is in vergelijking met CXCL9 en CXCL10.

In hoofdstuk 5 werd verder ingegaan op de rol van fosfolipase C in de signaal transductie van T cellen na stimulatie van CXCR3. Fosfolipase C zet een signaal route aan waardoor de concentratie van vrije calciumionen in de cel stijgt. Dit kan weer een reeks van processen activeren, maar het is nog niet duidelijk welke. Wij bestudeerden de rol van calcium in T cel migratie. Hieruit werd duidelijk dat cellen wel calcium nodig hebben, maar dat er daarvoor geen calcium vanuit de omgeving nodig is. Het calcium dat opgeslagen is in de cel is voldoende om de cel te laten migreren. Het is mogelijk dat de cel de signalering via calcium nodig hebben om de richting te bepalen waarin ze moeten migreren.

Hoofdstuk 6
In hoofdstuk 6 wordt onderzocht of de CXCR3-gedreven T cel migratie CXCR3 is af te remmen. Een aantal huidziekten wordt namelijk in verband gebracht met een verhoogde concentratie van CXCR3-dragende T cellen. Door een teveel aan actieve T cellen op een bepaalde plaats kunnen ongewenste reacties optreden. Daarnaast is gebleken dat CXCR3-dragende cellen een rol spelen in de afstoting van transplantaten (zoals hart en nier). Door middel van het blokkeren van de CXCR3-receptor, zou een chronische ontsteking verzacht of genezen kunnen worden doordat minder actieve T cellen naar de plaats van ontsteking worden aangetrokken. Door blokkade van de CXCR3-receptor bij transplantaties zou bovendien voorkomen kunnen worden dat afstoting plaatsvindt doordat actieve CXCR3-positieve T cellen naar het transplantaat migreren en de lichaamsvreemde cellen aanvallen. Voor verschillende chemokinereceptoren worden momenteel kleine moleculen ontwikkeld die binden aan de receptor en daardoor voorkomen dat de chemokines zelf binden en de cel activeren (antagonisten). Voor de CXCR3-receptor is onlangs een klein molecuul gemaakt dat deze functie heeft.

De afdeling Farmacochemie van de Vrije Universiteit van Amsterdam heeft deze antagonist zodanig weten te veranderen dat de binding aan de CXCR3-receptor verbeterd is en een mogelijke toepassing in de kliniek dichterbij komt. Met verschillende functionele test werd het effect op de cel bestudeerd. Hieruit bleek dat de antagonist de werking van chemokines op de cel kon blokkeren. In aanwezigheid van de antagonist reageerden de cellen niet op de relevante chemokines. De cellen migreerden niet naar de CXCR3-chemokines CXCL10 en -11, maar wel naar een ligand (CXCL12) van een andere chemokine receptor (CXCR4). Deze antagonist remt dus specifiek de migratie van T cellen die via CXCR3 gestimuleerd worden en niet via andere chemokine receptoren. Dit stofje is dus een aantrekkelijke kandidaat voor toepassing in de kliniek. Voordat deze antagonist als medicijn gebruikt kan worden is echter nog veel aanvullend onderzoek nodig, bijvoorbeeld naar de toxiciteit. Als de studies uitwijzen dat het veilig is, kan een medicijn gemaakt worden dat bijvoorbeeld chronische ontstekingen verzacht of geneest of de acceptatie van transplantaten bevordert.

Conclusie
De verschillende hoofdstukken laten enkele aspecten zien van het immuunsysteem die onderling met elkaar verbonden zijn. De beschreven bevindingen zijn slecht kleine facetten van een complex systeem. Elk stukje nieuw opgedane kennis is echter waardevol voor een beter begrip van de werking van het immuunsysteem en betere behandelmethodes voor ziektes waarbij het immuunsysteem betrokken is.

Summary:  

The immune system is a complex and well-organized organ. Knowledge of its function is crucial, not only for the treatment of infectious diseases and allergies, but also for many other disorders, such as autoimmunity and cancer, and for organ transplantation. In the skin, excessive infiltration of leukocytes are found in many inflammatory diseases. Two major players involved in acquired immune responses are the dendritic cell and the T cell. This thesis will focus on two aspects of this system; the maturation of DC and its antigen-presenting function and the trafficking of T cells, which can be considered as crucial steps in directing the acquired immune system.

The actin binding protein cofilin is dephosphorylated during DC maturation

The principal task of dendritic cells is to specifically direct T cells that are reactive with the antigens the DC has encountered and presents on its cell surface. In this process, the maturation state of the DC is of critical importance for T cell activation as it determines the outcome of the interaction between the DC with the T cell: activation or tolerance. The aim of the study described in chapter 2 was to identify novel proteins involved in DC maturation that may have a role in T cell activation.

To accomplish this, total protein expression profiles of immature and mature DC were compared by the combined use of two-dimensional gel-electrophoresis (2DE) and mass spectrometry (MS). Although both 2DE and MS are no new techniques, recent advances in the technology and software make it an attractive and promising methodology for the identification of differentially expressed proteins. 2DE is based in the separation of proteins first on their iso-electric point and then on their molecular weight. Commercially available gel strips used for the first dimension make 2DE less time-consuming and more reproducible. Furthermore, the resolution and sensitivity of the latest generation of mass-spectrometers has greatly increased. New software programs and the availability of advanced protein databases on the internet have facilitate the analysis of the results. The value of 2DE lies in the detection of differences in both protein expression levels and protein modifications. Protein expression profiles are more informative than mRNA expression profiles, as mRNA levels not always reflect protein levels. Moreover, many processes in the cell are not regulated by protein expression levels, but by modulation of the protein activity. The bulk of protein modifications result either in a shift in mass or iso-electric point, or both and can be visualized by 2DE and identified with MS.

The proteome of a cell is very complex; the number of proteins expressed at the same time in a given cell type is estimated at 6000, which in addition can exist in different forms as a result of post-translational processing and chemical modifications. By 2DE only a proportion of proteins from total cell lysates can be identified. As a result of the low solubility of most proteins greater than approximately 100 kDa, the failure to resolve and separate most membrane proteins and the resolution of the gel (Mann et al., 2001; Hatzimanikatis et al., 1999), mainly soluble and high abundant, low molecular weight proteins will be detected with this technique. Prefractioning of the samples or the use of multiple first dimension gel strips with distinct, narrow pH ranges may increase the yield of this technique.

In spite of these shortcomings, the differential modification of an actin-binding protein during (cofilin) DC maturation was identified by proteomic profiling using 2DE and MS, and is described in chapter 2. Cofilin is a small protein of 18 kD, which is inactive when phosphorylated on its serine on position 3 and is involved in cytoskeletal rearrangements. During maturation the protein spot identified as phosphorylated cofilin by MS, was strongly reduced. Western blot analysis confirmed a gradual loss of cofilin phosphorylation during LPS-induced maturation. In addition, cofilin was translocated towards the plasma membrane, where the actin cytoskeleton is located. Cofilin dephosphorylation correlated with an increase in filamentous actin (F-actin) and the development of veils. These data suggest involvement of cofilin in the formation of veils that are characteristic for mature DC.

Activation of cofilin results in an increased turnover of F-actin, thereby enhancing cytoskeletal rearrangements and increasing cell motility (Lappalainen and Drubin, 1997; Moon and Drubin, 1995; Chen et al., 2000). Furthermore, through its severing capacity it can promote actin polymerization by increasing the number of filament ends (Ichetovkin et al., 2002). In addition, cofilin has been demonstrated to promote actin-bundling (Pfannstiel et al., 2001). Cofilin is most likely not the only player involved in the cytoskeletal rearrangements leading to the appearance of veils on mature DC. Expression of the actin-bundling protein Fascin has been demonstrated in mature, but not immature DC. Also the ARP2/3 complex may be important for the dendritic appearance of DC, through its capacity to initiate and nucleate new actin filaments, as deficiency in Wiscott-Aldrich syndrome protein (WASp), the activator of Arp2/3, prevents the formation of podosomes in DC (Binks et al., 1998; Burns et al., 2001). Moreover, mRNA levels encoding a cross-linker of F-actin, MARCK, were elevated early during DC maturation. Also the microtubular network might be involved, as mRNA levels for -tubulin and dynein light chain were up-regulated (Huang et al., 2001). Other proteins that may be regulated during maturation are anchoring (ezrin/radixin/moesin, -actinin), actin-bundling (-actinin) and severing (gelsolin) proteins (Otey and Carpen, 2004; Takubo et al., 1999; Barreiro et al., 2002; Chou et al., 2002).

The formation of veils by DC may be of great importance for its antigen-presenting function. First, the enlarged cell surface enables the expression of high levels of peptide-MHC complexes and costimulatory molecules. Second, the chance to encounter and interact with antigen-specific T cells is increased. And most importantly, when DC-T cells contact is established it may increase the contact area between DC and T cells and thereby strengthen the activation signal that is delivered to the T cell. In other leukocytes, cofilin has been demonstrated to be involved in migration (Matsui et al., 2001; Konakahara et al., 2004; Nishita et al., 2002) and phagocytosis (Matsui et al., 2002). It remains to be established whether cofilin plays a similar role in migration and endocytosis of dendritic cells.

A mutation in the carbohydrate recognition domain of Langerin protein prevents Langerin-induced formation of Birbeck granules

The Langerhans cell (LC) is the dendritic cell of the epidermis and distinguishes itself from dermal and other DC by the expression of Birbeck granules. The type II C-type lectin Langerin, which is uniquely expressed in LC, has been shown to induce the formation of Birbeck granules when heterologously expressed in murine fibroblasts (Valladeau et al., 2000). The function of Birbeck granules is still poorly understood, but many data now suggest a role for Langerin in the processing and presentation of exogenous antigens. Understanding their ontogenisis may give clues for the function of these organelles. In 1994 the department of Dermatology in Leiden, the Netherlands, encountered a healthy individual (E. N.) whose LC completely lacked Birbeck granules (Mommaas et al., 1994). The aim of the work described in chapter 3 was to identify possible genetic defects underlying the deficiency in Birbeck granules.

Sequence analysis the Langerin gene of E. N. revealed a mutation in exon 5 in one of the Langerin alleles. This mutation was located in the area encoding the carbohydrate recognition domain (CRD) of Langerin and resulted in the replacement of a tryptophane at position 264 for an arginine residue (W264R) in a region that is highly conserved among related type II C-type lectins and among different species. Heterologous expression of the W264R form in human fibroblasts did not result in the formation of Birbeck granules, in contrast to the wildtype Langerin. The mutant Langerin could not be detected by the anti-Langerin monoclonal antibody DCGM4. However, linking green fluorescent protein (GFP) to the N-terminus of Langerin enabled the visualization of the protein in transfected cells with an anti-GFP antibody. Although no Birbeck granules were formed in GFP-W264R Langerin transfected cells, GFP-W264R Langerin was detected in irregular tubular membrane structures. Recently, a mutation in mouse Langerin cDNA resulting from a cloning artifact was described, which gave rise to the same phenotype when transfected in fibroblasts (Valladeau et al., 2002). Interestingly, this mutation was also located in the region encoding the CRD domain. Together, these data indicate an important role of the CRD of Langerin in the formation of Birbeck granules.

Anti-GFP staining of cells expressing GFP-wildtype Langerin revealed a regular repetitive pattern of GFP-Langerin along the Birbeck granules. In contrast, staining with anti-DCGM4 resulted in a much lower labeling of Birbeck granules, suggesting that the epitope for DCGM4 is engaged in the formation of the Birbeck granules and therefore not available for antibody binding. In cells transfected with GFP-W264R Langerin, staining with anti-GFP revealed the absence of a repetitive pattern of Langerin expression. Conversely, GFP-W264R Langerin transfected cells demonstrated a tubule-like structure highly positive for GFP, that was reminiscent of cored tubules (Hopkins et al., 1994; McDermott et al., 2002; Valladeau et al., 2000). The spatial organization of Langerin in the Birbeck granule implicates an active role for Langerin in the ontogenesis of the typical zipper like structure and suggests that Birbeck granules arise through the interaction of Langerin molecules with one another and/or ligands, possibly via its CRD. This was also proposed by Mc Dermott et al, who described the formation of Birbeck granules like structures at sites where Langerin accumulates. They hypothesize that a ''minimal zipping concentration" of these molecules is necessary in combination with preexisting tubular structure where close membrane apposition exists, like in the endosomal recycling compartment (Geissmann et al., 2002). This hypothesis is further strengthened by the observation that Langerin can bind mammalian high-mannosylated (endogenous) glycoproteins as well as glycoconjugates of microorganisms (Stambach and Taylor, 2003). This indicated that either Langerin interacts with high mannose structures on opposite Langerin molecules or opposite Langerin molecules might interact with the same glycosylated ligand that is present in cored tubules or the endosomal recycling compartment. A mutation in the CRD likely prevents the binding of glycoconjugates and thereby the zipping that is typical for the Birbeck like structures.

The next question was whether this mutation was unique or that it occurred more frequently in the population. The identified mutation could be detected with a simple assay consisting of PCR amplification of a small fragment of the Langerin gene followed by digestion with a restriction enzyme, specific for the mutated allele. Using this method, 3 additional persons in a total of 219 screened were detected. Like the index person, genomic DNA of all three encoded for both wildtype and W264R-Langerin (unpublished data). From one of these persons a skin biopsy was obtained and analyzed for the presence of Birbeck granules. However, in contrast to E. N., the Langerhans cells of this person (M) did contain Birbeck granules in normal numbers (unpublished data).

These data suggest that heterozygosity for W264R Langerin is not correlated with the absence of Birbeck granules per se. The phenotype (Birbeck granules or not) may be influenced by other factors, such as mRNA expression levels, the translation of mRNA into protein or protein degradation. The Langerhans cells of E. N. not only lacked Birbeck granules, but were also negative for anti-Langerin staining (Mommaas et al., 1994). It is thus unclear, whether one or both Langerin alleles are expressed on the protein level in the LC. Alternatively, the level of Langerin expression and/or the ratio of W264R- and wildtype Langerin expression may differ between both persons. If equal levels of mutant and wild type Langerin are expressed, the minimal zipping concentration of functional Langerin molecules, hypothesized by Mc Dermott et al. may not be reached (McDermott et al., 2002). However, if the total expression level of Langerin is increased or if wildtype Langerin expression exceeds the expression of the mutant, the minimal zipping concentration needed for the formation of Birbeck granules may still be reached and Birbeck granules may be formed despite the presence of the mutant Langerin protein in the cell.

The functional significance of the lack of Birbeck granules can be questioned, as the Birbeck granule deficient person was healthy and showed normal mixed lymphocyte reactions (Mommaas et al., 1994). Moreover, no function has been discovered for Birbeck granules as yet. For the function of Langerhans cells the expression of functional Langerin may be of greater importance than the presence of Birbeck granules itself. The zipper-like conformation of Birbeck granules may only be a 'side effect' of the accumulation of Langerin in tubular structures and have no specific function in itself. Langerin has been associated with the uptake of glycolipids and the presentation of these antigens via CD1a (Hunger et al., 2004) to T cells. This way, Langerin may play a crucial role in the directing of immune responses via non-peptide antigens derived from invading pathogens.

Involvement of different signal transduction pathways in CXCR3 signaling and their role in T cell chemotaxis

After activation, T cells have to find their way to the site of pathogen invasion or tissue trauma. Locally produced chemokines specifically direct leukocytes to distinct tissues and to sites of inflammation. In type 1 inflammatory responses of the skin CXCR3-ligands are involved in the recruitment of activated T cells. Many inflammatory disorders in the skin and throughout the body are associated with an excessive production of CXCR3-ligands and a massive infiltration of CXCR3+ T cells. Therefore, CXCR3 is an attractive target for the development of intervention therapies. For the evaluation and development of specific therapies intervening in CXCR3-mediated processes it is of importance to unravel the signal transduction pathways used by the receptor and their functional importance. The aim of the studies described in chapter 4 and 5 was to elucidate the pathways involved in CXCR3-mediated signaling and their functional importance for T cell migration and actin polymerization.

Beig typical for most Gi protein-coupled receptors, chemokine receptor triggering leads to an increase in intracellular calcium concentrations ([Ca2+]i). Chapter 5 demonstrates that [Ca2+]i in CXCR3-transfected CHO cells consists of the mobilization of Ca2+ from intracellular stores and the influx of extracellular Ca2+, the latter making up the major part of the calcium signal. Although essential for T cell migration, [Ca2+]i was not was needed for actin polymerization in T cells. Remarkably, CXCR3-mediated actin polymerization and T cell migration occurred completely independent of the influx of calcium into the cells, meaning that intracellular Ca2+ mobilization suffices for T cell migration. In experiments in T cells in which intracellular Ca2+ is depleted both T cell migration and actin polymerization were dependent on the presence of intracellular calcium and appeared to be regulated in a Ca2+-dependent manner, both in resting and in activated cells. In conclusion, CXCR3-induced T cell migration is independent of Ca2+ influx, but is dependent on Ca2+ concentrations in the cell and CXCR3-induced mobilization of intracellular Ca2+.

Receptor-mediated Ca2+ influx in T cells occurs predominantly via so-called store-operated calcium channels (SOC), which are activated through depletion of Ca2+ from intracellular Ca2+ stores. In T cells the only known SOC channel is the calcium release activated calcium (CRAC) channel. Ca2+ entry through CRAC channels is essential for T-cell activation and activation associated gene expression (IL-2 and -5 and IFN-) and proliferation (Ishikawa et al., 2003; Zitt et al., 2004; Fanger et al., 1995; Fischer et al., 2001). Voltage dependent Ca2+ channels (VDCC) were reported to be involved in T cell activation and proliferation (Kotturi et al., 2003) and in CX3CL1-induced [Ca2+]i in CHO cells expressing CX3CR1 (Kansra et al., 2001). In CXCR3-mediated T cell migration, however, calcium channels whether CRAC or VDCC have no apparent function. Nonetheless, it is still unclear whether influx of calcium is essential for chemokine-mediated activities other than migration, actin polymerization and kinase activation, such as integrin activation, gene transcription, or T cell proliferation (van Kooyk et al., 1991; Cinamon et al., 2001a; Cinamon et al., 2001b; Whiting et al., 2004; Lauffenburger and Horwitz, 1996).

In both chapter 4 and 5 the involvement of different kinases in CXCR3-induced signaling was investigated. All three ligands of CXCR3 (CXCL9-11) were capable of activating the PI3K/Akt and MEK/p44/42 pathway in a dose-dependent manner in both activated T cells and COS-7 cells expressing human CXCR3, CXCL11 being the most potent. All CXCR3-induced processes were mediated via Gi. CXCL11-induced phosphorylation of p44/p42 did not need a functional cytoskeleton, suggesting that receptor internalization was not involved in activation of this kinase. Activation of p44/p42 by CXCR3 relied completely on MEK, partially on PI3K and not on Ca2+. Also Akt was partially regulated by PI3K and was decreased in the absence of intracellular calcium. Both CXCR3-mediated T cell migration and actin polymerization depended on PLC-linked signal transduction pathways. Furthermore, in contrast to several other reports describing chemokine signaling, PI3K, MEK (chapter 4), and PKC (chapter 5) were not involved in CXCR3-induced chemotaxis.

Until recently, PI3K was thought to be indispensable for chemoattractant-induced migration (Bonacchi et al., 2001; Knall et al., 1997; Sotsios et al., 1999; Sullivan et al., 1999; Turner et al., 1998; Vicente-Manzanares et al., 1999; Wain et al., 2002; Wang et al., 2000). However, more recently it has become clear that PI3K dependence is not universal for all chemokine receptors. Several reports describe migration of leukocytes that is either completely (Cinamon et al., 2001b; Cronshaw et al., 2004; Heit et al., 2002; Scandella et al., 2002; Verploegen et al., 2002; Fine et al., 2001; Ward, 2004) or partially independent (Wain et al., 2002; Reif et al., 2004) of PI3K. Heit et al. suggested that signaling via PI3K depends on the receptor responding to either intermediary chemoattractants or end target chemoattractants. Neutrophil migration towards intermediary chemoattractants depended on PI3K/Akt activity, whereas end target chemoattractants induced migration occurred via p38. Moreover, 'end target' chemokines were dominant over 'intermediary' chemokines (Heit et al., 2002). The notion that CXCR3 mediated migration is independent of PI3K fits in this theory. However, CCR4-medated migration (Cronshaw et al., 2004) and PBL transendothelial migration (Cinamon et al., 2001b) that occur independently of PI3K do not fit in this description of 'end targeting'. Perhaps, dividing chemokines in dominant and weak is a more appropriate classification. Strikingly, Bonnacchi et al report that CXCR3-mediated migration is dependent on PI3K (Bonacchi et al., 2001). However, these results were obtained from pericytes and not T cells, indicating that chemokine receptor signaling not only depends on the type of receptor, but also on the cell type in which they are expressed. Also on MEK and PKC involvement in leukocyte migration contradictory reports exist, stating that chemokine induced chemotaxis is either independent or dependent on these kinases [MEK independency: (Stein et al., 2003; Knall et al., 1997; Bardi et al., 2003), P

Thus, although different receptors may use the same components of signal transduction pathways, the exact combination and the repertoire of kinases differ per receptor and probably also per cell type. It is likely that distinct signaling pathways are involved in the diverse effects of chemokine triggering (chemotaxis, gene transcription and proliferation), which may also differ per receptor and cell type. Also, triggering of chemokine receptors by different ligands may result in diverse effects. For example, binding by CCR2 of CCL2 and the CCR3-ligand CCL11 both induce the activation of p44/p42, although via different pathways. However, where CCL2 mediates chemotaxis, CCL11 prevents CCL2-induced migration (Ogilvie et al., 2004). Unraveling all signal transduction routes and their effects on cell activity and cell signaling, will be indispensable for the evaluation of new pharmaceutics that target chemokine receptors.

The biological activity of a small-molecule CXCR3 antagonist

To study the role of CXCR3+ infiltrating T cells in type 1 inflammatory disorders, specific CXCR3-antagonists may prove to be a valuable tool. In addition, the identification of high affinity CXCR3-antagonists may eventually lead to the development of intervening therapies. The aim of chapter 6 was to synthesize a small molecule CXCR3-antagonist with high affinity that blocks CXCR3-ligand-mediated signal transduction and human T cell migration.

The design of small molecule antagonists may lead to compounds with higher stability than peptidic agents and may be suitable for oral administration. In addition, small molecule antagonist may be able to penetrate through the skin and be used for local administration. Recently, it was demonstrated that a small molecule that was originally designed as a murine CCR4-antagonist also antagonizes murine CXCR3 (Yang et al., 2002). For the human CXCR3, only two antagonistic small-molecules have been described with a moderate binding affinity (Schall et al., 2001). Chapter 6 describes the modification of one of these compounds to increase its affinity to CXCR3. At the Department of Pharmacochemistry (Free University, Amsterdam), different compounds were synthesized based on the lead compound (Schall., et al. 2001) and tested in radio-ligand binding assays. Compound VUF5834 demonstrated the highest affinity for CXCR3 and effectively prevented CXCR3-ligand-induced activation of phospholipase C and CXCR3-mediated [Ca2+]i in cells transfected with the human CXCR3. Moreover, in T cells, 1 µM of VUF5834 completely abrogated CXCR3-mediated actin polymerization and T cell migration. This effect was specifically mediated via binding to CXCR3, as VUF5834 did not inhibit CXCR4-mediated T cell migration and a non-binding analogue of VUF5834 had no effect on CXCR3-mediated signaling and T cell migration. In conclusion, the small molecule VUF5834 specifically antagonizes CXCR3 via interaction with the receptor.

VUF5834 did not affect T cell chemotaxis induced by CXCR4-ligand CXCL12, indicating that the action of this antagonist is limited to CXCR3. Nevertheless, cross-reactivity of VUF5823 with other chemokine receptors remains to be determined, in particular with CCR3 and CCR5. Recently, the three ligands of CXCR3 were discovered to act as antagonists for CCR3 (Xanthou et al., 2003). In addition, CXCL11 is a natural antagonist of CCR5 (Petkovic et al., 2004). CXCR3 antagonist may therefore not only bind to CXCR3 but also to CCR3 and CCR5. Already, the murine CCR5 antagonist TAK-779 was shown to antagonize both CCR5 and CXCR3 (Yang et al., 2002).

For future studies on the in vivo effect of VUF5834 test animals will be indispensable. First, to asses toxicity and assemble information on the route of administration and bioavailability. Secondly, to study its effect on in vivo trafficking of CXCR3+ T cells. In this respect, it would be preferable that the antagonist not only binds to the human receptor but also antagonizes CXCR3 of mammalian test-animals. The murine and human CXCR3 and their ligands share a high homology with each other. Murine CXCL11 also triggers human CXCR3, although with lower potency (Meyer et al., 2001). However, human CXCL11 does not activate the murine CXCR3 (unpublished data). In case mice are selected for in vivo experiments, the binding affinity of VUF5834 for the murine CXCR3 and its capacity to antagonize murine CXCR3 ligands should be determined.

For therapeutic applications, the route of administration may determine the effect of antagonists. Oral or intravenous administration will result in total body availability of the antagonist. If inhibition is complete this will prevent the recruitment of all CXCR3+ T cells to site of inflammation producing CXCR3-ligands. Local administration, for example local injection or via penetration of the skin, will likely not prevent the initial recruitment of CXCR3+ T cells, but may attenuate the immune response, by preventing the local activation of CXCR3+ T cells (IFN- production and proliferation). Depending on the type of inflammatory disease either complete inhibition or attenuation of CXCR3+ T-cell-mediated responses may be desirable.