Promoties Geneeskunde

Korte samenvatting:

Regulatoire T-cellen helpen het immuunsysteem in balans te houden, door ontstekingsreacties te temperen. Bij autoimmuunziektes als reumatoïde artritis (RA), waarbij het immuunsysteem lichaamseigen cellen in gewrichten aanvalt, zouden deze cellen als therapie kunnen dienen. Een groot voordeel ten opzichte van de nu gebruikelijke therapieën zou zijn dat patienten volledig kunnen herstellen. Uit Morgans onderzoek aan muizen blijkt dat regulatoire T-cellen de ziektesymptomen verminderen en de ontwikkeling van de ziekte kunnen remmen. Transplantatie van deze cellen kan de natuurlijke progressie vertragen. Morgan is optimistisch over de toepassing van regulatoire T-cellen als therapie in de strijd tegen RA.

Samenvatting:

Reumatische artritis (RA) komt wereldwijd in ongeveer 0.5-10% van de volwassenen populatie voor. Hoewel een klein deel van deze mensen spontaan geneest, heeft de overgrote meerderheid (90%) hun leven lang last van de symptomen. Huidige therapieën bestaan hoofdzakelijk uit ontstekingsremmende medicijnen die zich alleen richten op de symptomen of het vertragen van de ernst van de ziekte. De beste therapie is uiteraard het volledig genezen van de ziekte en het weer herstellen van de regulatie van de auto-immuun respons en chronische ontstekingen. Deze thesis bestudeert mogelijkheden voor permanent herstel door te onderzoeken hoe het lichaam op natuurlijke wijze immuunreacties reguleert in artritis en hoe dit regulatiemechanisme gebruikt kan worden in therapieën. 

Het immuunsysteem
Het immuunsysteem is een wonderbaarlijk complexe organisatie van cellen en eiwitten die ons voortdurend beschermen tegen ziekten, veroorzaakt door pathogenen. Gedurende een infectie met pathogene worden bepaalde celtypen gealarmeerd, die vervolgens het ontstekingsproces starten door de productie van chemische signalen (cytokinen). Men merkt dit fysiek op als plekken die ontstoken zijn, gekenmerkt door zwellingen, warmteafgifte en rood gekleurd weefsel. Macrofagen en antigen presenterende cellen (APC) detecteren als eerste de pathogenen doordat ze kenmerken herkennen met behulp van receptoren. Voornoemde cellen vormen de eerste “verdedigingslinie” in een infectie. Er is echter ook een tweede bescherming aanwezig in de vorm van een zogenaamde aangepaste immuniteit, bestaande uit T-cellen en B-cellen. Deze cellen worden geactiveerd door voornoemde antigen presenterende cellen (de APC). 
Zodra T-cellen zijn geactiveerd kunnen ze het lichaam op verschillende manieren beschermen. T-cellen zijn in staat om andere cellen te wijzen op infecties door de productie van verschillende cytokinen en door directe cel-tot-cel communicatie. Sommige T-cellen kunnen geïnfecteerde cellen vernietigen en anderen kunnen de activiteiten van B-cellen stimuleren. 
B-cellen zijn verantwoordelijk voor de productie van antilichamen. Tijdens vaccinaties, zoals de Tetanus-prik, wordt geprobeerd antilichamen te produceren die pathogenen kunnen herkennen. Antilichamen blijven letterlijk aan pathogenen plakken, waardoor het makkelijker voor het immuunsysteem wordt om ze te vernietigen.
Hoewel het proces van ontsteking ideaal is voor het vernietigen van pathogenen, blijkt dat langdurige of verkeerd gerichte ontsteking gevaarlijk kan zijn. Zoals ieder wapen dient het immuunsysteem strikt gecontroleerd te worden omdat de activiteiten van het immuunsysteem schade kunnen toebrengen aan gezond weefsel. Dit wordt gedemonstreerd door autoimmuunziekten, waarbij het immuunsysteem het eigen weefsel aanvalt en veroorzakt een chronische ontsteking. Ziekten zoals multiple sclerosis, reumatische artritis, type I diabetes en lupus zijn voorbeelden van ontregelde immuunreacties. Het is daarom essentieel voor de gezondheid dat immuunreacties gebalanceerd worden door acties die ontstekingen verminderen (anti-ontstekings respons). Vanwege dit risico heeft het lichaam ook T-cellen die de ontsteking verminderen, genaamd regulatoire T-cellen.

Regulatoire T-cellen
Regulatoire T-cellen helpen het immuunsysteem in balans te houden doordat ze de processen van ontsteking temperen. Hoe deze cellen precies werken is nog steeds niet duidelijk. Er zijn echter aanwijzigen dat ze andere cellen beïnvloeden door cel-tot-cel communicatie of door het gebruik van cytokinen. Ondanks het gebrek aan exacte kennis over het onderdrukkende mechanisme van regulatoire T-cellen is het overduidelijk dat ze een rol hebben in het voorkomen van autoimmuunziekten. Daarom komen regulatoire T-cellen in aanmerking voor als een potentiële therapie in autoimmuunziekten. Het voordeel van deze cellen, in vergelijk ten opzichte van de vele medicijnen die momenteel worden geproduceerd, is dat regulatoire T-cellen in potentie patiënten permanent kunnen genezen. Deze thesis concentreert zich op deze mogelijkheden. 

Betrokkenheid van regulatoire T-cellen bij de ziekte ontwikkeling 
In hoofdstuk twee is de betrokkenheid van regulatoire T-cellen op de natuurlijke ontwikkeling van artritis onderzocht. Voor de uitvoer van dit onderzoek is gebruik gemaakt van een muis-model voor reumatische artritis, ook wel collageen-geïnduceerde artritis genaamd (CIA). In dit betreffende model wordt een autoimmuunreactie opgewekt tegen gewrichtseiwitten (type II collageen), waardoor gewrichtsontsteking ontstaat. 
Om te onderzoeken of van nature voorkomende regulatoire T-cellen de ontwikkeling van artritis kan temperen, werd voorafgaand aan het induceren van collagene artritis de meerderheid van de regulatoire T-cellen uit de muizen gehaald. Zoals verwacht ontwikkelden muizen met weinig regulatoire T-cellen zwaardere ziektesymptomen. Dit kwam ook naar voren in andere geteste parameters, zoals antilichaam respons en de algehele T-cel activiteit gericht tegen gewrichtseiwitten of antigenen. 

Effecten van HLA-DQ8 op het functioneren van regulatoire T-cellen 
Collageen geïnduceerde artritis is niet het enige model waarmee reumatische artritis wordt gesimuleerd, er zijn ook andere modellen voor de ziekte. Een van deze modellen gebruikt transgene muizen (transgene muizen zijn genetisch aangepast zodat ze specifieke eiwitten tot expressie laten komen) die een menselijk eiwit (HLA-DQ8 class II) produceren, dat geassocieerd wordt met reumatische artritis. Hierdoor worden de muizen gevoelig voor artritis. In hoofdstuk drie is het functioneren van regulatoire T-cellen in HLA-DQ8 transgene muizen onderzocht om te bepalen of de expressie van HLA-DQ8 de ontwikkeling van regulatoire T-cellen beïnvloedt. Dit is onderzocht middels experimenten met regulatoire T cel depletie (vergelijkbaar met experimenten zoals beschreven in hoofdstuk twee). Ook is onderzocht of geïsoleerde regulatoire T-cellen in vitro een immuun respons kunnen onderdrukken. Regulatoire T-cellen van HLA-DQ8 transgene muizen bleken in vitro normaal te zijn en in vivo waren ze in staat de ontwikkeling van artritis te beïnvloeden. Deze resultaten versterken de conclusie uit hoofdstuk twee dat regulatoire T-cellen betrokken zijn bij het modulatie van reumatische artritis in mensen. Tevens suggereert het dat HLA-DQ8 de correcte ontwikkeling en fucntionering van regulatoire T-cellen niet verstoort.

Transplantatie van regulatoire T-cellen als therapie 
Een logische manier om regulatoire T-cellen in te zetten in de bestrijding van autoimmuunziekten, is het transplanteren van deze cellen in zieke individuen. Dit is reeds succesvol toegepast in een muismodel met colitis. In colitis is het ontstoken orgaan echter de dikke darm en niet het gewricht. Tevens wordt colitis gekenmerkt door een overactieve T-cell respons. Ons artritismodel is meer afhankelijk van B-cel reacties. Om die rede wilden we het effect van regulatoire T-cellen op ons model van autoimmuunziekte vaststellen. Als beschreven in hoofdstuk vier hebben we regulatoire T-cellen uit gezonde muizen gehaald en deze getransplanteerd in muizen met eerste fase artritis. Vervolgens bleek dat de transplantatie van regulatoire T-cellen de natuurlijke progressie van artritis, in een therapeutische omgeving, kon vertragen. De beste resultaten zijn verkregen door of het transplanteren van grote hoeveelheden cellen of de combinatie van regulatoire T-cellen en een beenmerg transplantatie. Beenmerg transplantatie vervangt het immuunsysteem van de patiënt door het immuunsysteem van een donor, vaak gebruikt in bijvoorbeeld leukemiepatiënten. 
De getransplanteerde regulatoire T-cellen bleken naar vrij veel verschillende type weefsels te gaan, inclusief synoviale weefsel in het gewricht. Deze bevinding is interessant omdat het suggereert dat de, door de regulatoire T-cellen geïnitieerde, anti-ontstekingsrespons gelokaliseerd kan zijn in het gewricht. Door te weten waar deze cellen opereren krijgen we tevens meer inzicht in het regulatiemechanisme. Deze kennis is op zijn beurt weer nodig voor het verbeteren van therapieën.

Merkers voor regulatoire T-cellen
Een ander punt van aandacht voor onderzoekers van regulatoire T-cellen is hoe ze te herkennen.. Momenteel wordt de celmarker CD25 gebruikt om regulatoire T-cellen te herkennen. CD25 kan echter, als gevolg van activatie, ook voorkomen op ander T-cel typen, en is daarom geen unieke marker voor regulatoire T-cellen. In muizen komt ook een ander type marker voor, de transcriptie factor Foxp3 (een transcriptie factor is een eiwit wat de expressie van genen controleert). Het zou ideaal zijn als voornoemde marker ook gebruikt kon worden voor het herkennen van regulatoire T-cellen in mensen. Verschillende studies hebben dit reeds indirect aangetoond. Er is echter nog steeds een gebrek aan diepgaande studies. In hoofdstuk vijf hebben we geprobeerd om duidelijkheid te scheppen in het belang van Foxp3 in regulatoire T-cellen. Onze resultaten wijzen erop dat Foxp3 ook gevonden kan worden in gevorderde pro-ontsteking T-cellen. Het is daarom riskant om Foxp3 expressie te gebruiken als een unieke marker voor menselijke regulatoire T-cellen. 

Conclusies 
Deze thesis wijst op een toegenomen rol van regulatoire T-cellen in de therapie van autoimmuunziekten. Onze studies, gebruikmakend van wijdverbreide modellen voor artritis in muizen, tonen aan dat regulatoire T-cellen de uitkomst van artritis kunnen beïnvloeden en dat ze gebruikt kunnen worden in therapieën. Dit is een positieve ontwikkeling voor reumatische artritis patiënten en wij verwachten dat toekomstig onderzoek verder ingaat op de erkenning van regulatoire T-cellen in mensen en hun capaciteit om menselijke autoimmuunziekten te genezen. 

Summary:  

Rheumatoid arthritis (RA) occurs in 0.5-10% of the worldwide adult population. Though, a small percentage of these individuals may spontaneously heal, the majority of patients (90%) will suffer symptoms throughout their lifetimes. Current therapies for these patients consist mainly of anti-inflammatory drugs that only target disease symptoms or slow progression. The best therapy, of course, would permanently reverse the disease and restore regulation of autoimmune responses and chronic inflammation. This thesis examines this possibility by researching how the body naturally regulates immune reactions in arthritis and by attempting to harness these regulatory mechanisms for therapy. 

The immune system 
The immune system is a wonderfully complex organization of cells and proteins that continually protects us against disease that can be caused by pathogens. During infection with, for example, bacteria, certain cell types become alerted and start the inflammatory process. This is detected physically as sites of inflammation on the body, which are characterized by areas of swelling, warmth, and redness. Macrophages and antigen presenting cells (APC) are the cells that detect pathogens first, recognizing particular hallmarks of the pathogen through receptors. These cells are the first line of defense in an infection. However, a second line of protection is provided through what is called the “adaptive immunity” consisting of T cells and B cells. These cells, like soldiers, must be called into duty by the APC. The most prominent cell type of this kind is the dendritic cell and they are able to direct the activities of T cells.
Once activated, T cells are able to defend the body in several ways. T cells are able to alert other cells to infection by the production of chemical messages (cytokines) and through direct cell to cell communication. Some T cells are able to destroy infected cells and others can stimulate the activities of B cells. 
B cells are responsible for the production of antibodies. During common vaccinations, such as the tetanus shot, the main goal is to produce antibodies recognizing infectious agents. Antibodies literally stick to pathogens and this process helps target them for destruction by the immune system. 
Though the processes of inflammation are ideal for fighting pathogens; prolonged or misdirected inflammation can be dangerous. Like any weapon, the immune system must be tightly controlled as its activities can unwittingly damage healthy tissues. This fact is demonstrated by autoimmune disease, which occurs when the immune system attacks its own tissues and causes a chronic inflammation. Diseases like multiple sclerosis, rheumatoid arthritis, type I diabetes, and lupus are all examples of the consequences of misdirected immune reactions. It is, therefore, essential for health that immune responses are balanced by actions that diminish inflammation (anti-inflammatory responses). Because of these risks, the body also has a subset of T cells that decrease inflammation and these are called T regulatory cells.

Regulatory T cells
T regulatory cells help keep the immune system in balance by tempering the processes of inflammation. How these cells work is still uncertain, however, it is reported that they may influence other immune cells through cell-cell contact or cytokines. Despite a lack of clear working knowledge about their suppressive mechanism, they’re involvement in autoimmune diseases is clear. As a result, they’re now being scrutinized as a potential autoimmune disease therapy. The advantage of T regulatory cell treatment, in comparison to the many drugs now being developed, is that this treatment may have the potential to permanently cure patients. This thesis focuses on this prospect.

Involvement of T regulatory cells on disease development
In chapter two, we investigated the involvement of T regulatory cells on the natural development of arthritis. To do this, we used a mouse model of rheumatoid arthritis, called collagen-induced arthritis (CIA). In this model, an autoimmune response is induced against joint proteins (type II collagen) and results in joint inflammation. 
To examine if naturally occurring T regulatory cells could tamper the development of arthritis, we eliminated the majority of T regulatory cells from the mice before inducing CIA. As we expected, we found that mice developed a more severe disease when they had very few T regulatory cells. This was also reflected in other parameters tested, such as the antibody response and the overall T cell activity directed against joint proteins or antigens.

Effects of HLA-DQ8 on T regulatory cell function 
CIA is not the only model used to mimic rheumatoid arthritis; additional models do exist for the disease. One of these uses a transgenic mouse (Transgenic mice are genetically engineered to express foreign genes.) expressing a human protein associated with rheumatoid arthritis (HLA-DQ8 class II) that causes the mice to be susceptible to arthritis. In chapter three, we examined T regulatory cell function in HLA-DQ8 transgenic mice to determine if the aberrant expression of the human protein influenced the development of T regulatory cells. This was done by performing T regulatory cell-depletion experiments (similar to those described in chapter two) and by examining the ability of isolated T regulatory cells to suppress immune responses in vitro. T regulatory cells from HLA-DQ8 transgenic mice appeared normal in vitro and they could influence arthritis progression in vivo. These results strengthen the conclusion from chapter two that T regulatory cells are involved in modulating rheumatoid arthritis in humans and suggest that HLA-DQ8 is not detrimental to the proper development and function of regulatory T cells. 

T regulatory cell transfer as therapy
A likely treatment of autoimmune disease using T regulatory cells would involve the transfer of these cells into diseased individuals. This has been successfully applied in a mouse model of colitis. However, in colitis the inflamed organ is the colon and not the joint and, furthermore, colitis is characterized by an overactive T cell response. Our model of arthritis is more dependent on B cell responses. Therefore, we wished to determine the effect of T regulatory cells on our autoimmune disease model. As described in chapter four, we harvested T regulatory cells from naïve mice and transferred them to mice suffering from early-stage arthritis. We found that the transfer of T regulatory cells could retard the natural progression of arthritis in a therapeutic setting. The best results were found when either large numbers of cells were transferred or the when the transfers were combined with bone marrow transplantation, a technique that literally replaces the host immune system with one from a donor and is often performed in leukemia patients. 
The transferred T regulatory cells were found to travel to a wide variety of tissues including synovial tissue in the joint. This finding is of interest because it suggests that the anti-inflammatory response, initiated by the T regulatory cells, could be located in the joint. By knowing where these cells act, we gain insight into their regulatory mechanisms and this knowledge can lead to better therapeutic protocols. 

Markers of T regulatory cells
Another matter of concern for those specializing in the study of regulatory T cells is how to identify them. Currently, the cell marker CD25 is used to identify these cells. However, CD25 can occur on other T cells as a result of activation, therefore it is not unique marker for these cells. In mice, another marker exists. The transcription factor Foxp3 appears to be a unique marker for murine T regulatory cells. (A transcription factor is a protein that controls the expression of other genes.) It would be ideal if the same marker could be used to recognize T regulatory cells in humans. Several studies have indirectly suggested this idea, however, in depth studies are still lacking. In chapter five, we attempted to clarify the importance of Foxp3 in human T regulatory cells. Our results indicated that Foxp3 could also be found in established pro-inflammatory T cells. Therefore, it is risky to use Foxp3 expression as a unique marker for human T regulatory cells. 

Conclusion
This thesis points to an increased involvement of T regulatory cells in autoimmune disease therapy. Our studies using an accepted model of arthritis in mice have demonstrated that T regulatory cells can affect the outcome of arthritis and can be used therapeutically. This is a positive development for rheumatoid arthritis patients and we can expect future research to focus on the improved identification of T regulatory cells in humans and their ability to treat human autoimmune diseases.