Promoties Geneeskunde

Korte samenvatting:

Cytotoxische T-cellen kunnen afwijkende cellen herkennen en doden. In theorie zouden ze ook veel tumorcellen moeten kunnen ontmaskeren en vernietigen, maar dat blijken ze in de praktijk vaak niet te doen.
Geertje van Mierlo legt uit, dat het niet voldoende is wanneer cytotoxische T-cellen afwijkende cellen herkennen. Een T-cel slaat pas toe, als hij daar een tweede signaal bij krijgt, afkomstig van zogenoemde dendritische cellen. Die moeten op hun beurt eerst weer geactiveerde worden door gealarmeerde T-helpercellen. Maar als het om tumorcellen gaat, raken de T-helpercellen niet gealarmeerd. Van Mierlo laat zien, hoe je in dat geval de dendritische cellen toch zou kunnen activeren.

Samenvatting:

Het onderzoek beschreven in dit proefschrift werd gefinancierd door KWF Kankerbestrijding.

Ons afweersysteem bestaat uit vele onderdelen die allemaal nauw met elkaar samenwerken om ons lichaam te beschermen tegen allerlei soorten ziekteverwekkers, zoals bacteriën en virussen. Omdat sommige soorten kanker vaker voorkomen bij mensen met een verzwakte afweer, ontstond het idee dat het afweersysteem ook een rol zou kunnen spelen bij het herkennen en opruimen van tumorcellen. Om het in dit proefschrift beschreven onderzoek te kunnen begrijpen, is het belangrijk iets over de werking van het afweersysteem uit te leggen. 

Aangeboren en verworven afweer
Het afweersysteem kan worden opgedeeld in een aangeboren en een verworven component. Bij aangeboren afweer worden stoffen uit het lichaam opgeruimd doordat structuren van ziekteverwekkers herkend worden die bij verschillende ziekteverwekkers voorkomen, en vormt daardoor een belangrijke en brede eerstelijns verdediging tegen vele micro-organismen. De verworven afweer, ook wel specificieke immuniteit genoemd, kan indringers specifiek herkennen en opruimen. Daarnaast is de specifieke afweer bij een tweede infectie met dezelfde ziekteverwekker beter in staat deze ziekteverwekker op te ruimen, door sneller en efficiënter op te treden. 

Het specifieke afweersysteem
Het specifieke afweersysteem bestaat uit twee takken, de B- en de T-cellen (ook wel lymfocyten genoemd). B-cellen ontstaan in het beenmerg en na activatie produceren zij antilichamen (ook wel antistoffen genoemd). Deze antilichamen binden aan de ziekteverwekker waarna andere componenten van het afweersysteem de ziekteverwekker gemakkelijker kunnen verwijderen. T-cellen ontwikkelen zich in de thymus. Op het oppervlak van elke T-cel zit een unieke receptor die een bepaald stukje eiwit (peptide) kan herkennen, maar alleen als dit peptide zich op een speciaal presentatie-molecuul (MHC genaamd) bevindt. Er zijn twee soorten MHC-moleculen, MHC klasse I en MHC klasse II, die elk herkend worden door een van de twee soorten T-cellen die het specifieke afweersysteem kent. 
De killer T-cellen herkennen hun specifieke peptide gebonden op MHC klasse I op het oppervlak van vrijwel elke lichaamscel. Alle eiwitten die in een cel voorkomen worden op een gegeven moment afgebroken tot peptiden (stukjes eiwit). Deze peptiden worden vervolgens in MHC klasse I gebonden en naar het celoppervlak getransporteerd. Een cel die door een virus geïnfecteerd is zal op deze manier ook virale peptiden presenteren op het celoppervlak. Zo kunnen de killer T-cellen herkennen welke cellen geïnfecteerd zijn met een virus, omdat bij niet-geïnfecteerde cellen alleen lichaamseigen peptiden gebonden zijn in het MHC klasse I. De geïnfecteerde cellen zullen door de killer T-cellen worden gedood. 
T-helper cellen herkennen peptiden die gepresenteerd worden in MHC klasse II moleculen. MHC klasse II wordt alleen gevonden op het oppervlak van cellen die gespecialiseerd zijn in het activeren van T-cel gemedieerde afweerresponsen, de zogenaamde professionele antigeen presenterende cellen. Omdat deze cellen zowel MHC klasse I als MHC klasse II op hun oppervlak hebben, zijn zij, onder de juiste omstandigheden, in staat een sterke T-cel respons op te wekken die nodig is om ziekteverwekkers uit te schakelen. 

Antigeen presenterende cellen 
Cellen die als antigeen presenterende cel kunnen fungeren zijn dendritische cellen, B-cellen en macrofagen. Lichaamsvreemde eiwitten (antigenen) worden in de periferie opgenomen door de professionele antigeen presenterende cellen. De antigeen presenterende cellen migreren dan naar de lymfeknopen of de milt (lymfoïde organen), waar de T-cellen verblijven die nog geen lichaamsvreemde peptiden hebben waargenomen (naieve T-cellen).

Activatie van killer T-cellen
Om killer T-cellen te activeren (dat wil zeggen: klaar te maken om geïnfecteerde cellen te doden) zijn 2 signalen nodig. Ten eerste moet de T-cel het lichaamsvreemde peptide gebonden aan MHC herkennen (signaal 1), maar daarnaast moet ook een tweede co-stimulatoir signaal (signaal 2) aan de T-cel gegeven worden voordat de T-cel in staat zal zijn om geïnfecteerde cellen in de periferie te doden. Dit tweede co-stimulatoire signaal kan alleen gegeven worden door de professionele antigeen presenterende cel als deze zelf ook geactiveerd is. Hiervoor zijn de T-helpercellen nodig. Als T-helpercellen hun specifieke peptide herkennen op het MHC klasse II van de professionele antigeen presenterende cel, zullen zij het molecuul CD40-ligand op hun celoppervlak krijgen. Dit CD40-ligand kan een signaal aan de antigeen presenterende cel geven via het molecuul CD40 op het oppervlak van de antigeen presenterende cel, waardoor de antigeen presenterende cel geactiveerd wordt. Activatie van antigeen presenterende cellen gaat gepaard met een verhoging van een aantal co-stimulatoire moleculen op het oppervlak van de antigeen presenterende cel. Pas na deze activatie, ook wel maturatie genoemd, zijn de antigeen presenterende cellen in staat de naieve killer T-cellen te activeren.
Dit gebeurt doorgaans zeer efficient als ergens in het lichaam een ontsteking aanwezig is, door bacteriën, virussen of andere ziekteverwekkers. Wanneer echter geen ontsteking aanwezig is, zullen T-helpercellen niet in staat zijn de antigeen presenterende cellen te activeren via de CD40-CD40-ligand interactie en zullen de killer T-cellen dus alleen het peptide/MHC signaal krijgen. Als T-cellen wel een peptide/MHC herkennen (signaal 1) maar niet een co-stimulatoir signaal (signaal 2) ontvangen kan tolerantie optreden. Tolerante T-cellen zijn niet in staat hun specifieke ziekteverwekker te doden, bijvoorbeeld doordat de T-cellen niet meer reageren op het “zien” van hun specifieke ziekteverwekker (anergie) of doordat de T-cellen dood gaan na het ontvangen van signaal 1 in afwezigheid van signaal 2 (deletie). 
Omdat tumoren ontstaan vanuit normale weefsels en meestal groeien zonder ontsteking te veroorzaken, is de kans groot dat de T-cellen die de tumor-eiwitten herkennen worden uitgeschakeld (getolerizeerd). Een groot deel van het onderzoek beschreven in dit proefschrift is op deze aanname gebaseerd.

Het gebruikte tumor model
In het geval van een tumor kunnen dus tumor-specifieke killer T-cellen worden uitgeschakeld doordat de naieve T-cellen voor het eerst in contact komen met hun antigeen in afwezigheid van co-stimulatie. Dit gebrek aan co-stimulatie kan het gevolg zijn van afwezigheid van geactiveerde T-helper cellen die antigeen presenterende cellen kunnen matureren (via CD40) omdat de tumor groeit in een niet-ontstoken omgeving, waarin dus geen signaal van “gevaar” gegeven wordt. Voor de experimenten die worden beschreven in dit proefschrift is gebruik gemaakt van een muis-tumor model. Tumorcellen werden buiten de muis in flessen gekweekt en daarna onderhuids ingespoten bij muizen. Alleen op de plaats waar tumorcellen ingespoten werden groeide een tumor. Omdat de tumor niet uitzaaide naar andere plekken, ondervonden de muizen vrijwel geen hinder van de onder de huid groeiende tumor. De gebruikte tumorcellen presenteren een E1A-peptide op hun oppervlak in MHC klasse I moleculen, waardoor het mogelijk was tumor-specifieke killer-T-cellen (killer-T-cellen die specifiek het tumor-antigeen herkennen), te volgen in de verschillende organen van tumordragende muizen. 

Hoofdstuk 2: Afstoting van tumoren door activatie van killer T-cellen
In het tweede hoofdstuk van dit proefschrift hebben we gekeken naar de spontane ontwikkeling van killer-T-cellen gericht tegen een tumor. We zagen dat het E1A-peptide dat door de tumorcellen geproduceerd werd, door het afweersysteem kan worden herkend als “vreemd”, d.w.z. niet lichaams-eigen. Dit leidde in een deel van de tumordragende muizen tot het ontstaan van tumor-specifieke killer-T-cellen in de tumor drainerende lymfeklier. Deze cellen blijven echter in de lymfeklier en kunnen daardoor niet dicht bij de tumorcellen komen om deze op te ruimen. Als deze tumordragende muizen worden behandeld met een antilichaam dat CD40 kan activeren, worden de tumoren wel opgeruimd. Dit komt doordat de tumorspecifieke killer T-cellen nu wel de lymfeklier verlaten, en door het hele lichaam kunnen migreren. Omdat de killer T-cellen nu in grote aantallen door het hele lichaam kunnen migreren, zijn zij ook in staat tumoren op te ruimen die op een andere plaats in het lichaam zitten dan waar het antilichaam was ingespoten. Deze anti-tumor behandeling kan dus erg nuttig zijn voor het behandelen van mensen met uitzaaiïngen (metastasen).

Hoofdstuk 3: Afweerreacties tegen tumoren die in het oog groeien worden onderdrukt
In sommige organen kunnen afweerreacties leiden tot functieverlies van het betreffende orgaan. Het oog is zo’n orgaan waarin afweerreacties kunnen zorgen voor verlies van zicht, wat in de natuur levensbedreigend kan zijn. In het oog hebben zich daarom verschillende mechanismen ontwikkeld die zorgen dat afweerreacties onderdrukt worden. Tenminste twee van deze mechanismen worden duidelijk in hoofdstuk 3. Als we tumorcellen in de voorste oogkamer (aangegeven als “AC” in figuur 1 van hoofdstuk 3) injecteren, wordt, net als bij onder de huid groeiende tumoren, het E1A-peptide alleen in de tumor drainerende lymfeklier aan de killer T-cellen gepresenteerd. Ook bij de oogtumoren leidt dit tot aanwezigheid van tumor-specifieke killer T-cellen die in de lymfeklier blijven steken. Bij muizen met een oogtumor die worden behandeld met het activerende anti-CD40 antilichaam blijven deze T-cellen echter nog steeds in de tumor drainerende lymfeklier, en gaan dus niet het bloed in op zoek naar de tumor zoals we zagen bij de onder de huid groeiende tumoren. Waarschijnlijk komt dit doordat de antigeen presenterende cellen uit het oog door de afweeronderdrukkende mechanismen in het oog, zijn gemanipuleerd zodat zij niet meer gevoelig zijn voor maturatie door het anti-CD40 antilichaam. Muizen die zowel een oogtumor als een onderhuidse tumor hebben, ruimen na CD40-activatie wel de onderhuidse tumor op, maar niet de tumor die zich in het oog bevindt, ook al dragen deze beide tumoren hetzelfde E1A-peptide op hun oppervlak. De killer-T-cellen die uit de lymfeklier ontsnappen zijn dus niet in staat ook de tumor in het oog te bereiken. Dit wordt waarschijnlijk veroorzaakt door een mechanische barrière tussen het bloed en het oog. Dus, het oog heeft verschillende mechanismen waarop afweerreacties in het oog worden tegengegaan: 1) veranderen van de antigeen presenterende cellen die antigenen uit het oog presenteren, zodat deze antigeen presenterende cellen niet in staat zijn T-cellen te activeren, en 2) door ervoor te zorgen dat T-cellen d

Hoofdstuk 4: anti-CD40 behandeling werkt via activatie van de antigeenpresenterende dendritische cellen
Hoewel tumorcellen door het afweersysteem wel als “lichaamsvreemd” herkend worden, worden ze toch niet opgeruimd. Zoals eerder vermeld is dit waarschijnlijk te wijten aan de afwezigheid van signalen die op “gevaar” duiden. Hierdoor zullen antigeen presenterende cellen die het tumor-antigeen opnemen en aan het afweersysteem presenteren (zgn. cross-presentatie) niet in geactiveerde staat verkeren en daarom geen co-stimulatoir signaal geven. Echter, een andere mogelijkheid is dat tumorcellen zelf naar de drainerende lymfeklier gaan. Aangezien tumorcellen wel het tumor-antigeen op hun oppervlak hebben, maar geen co-stimulatoire moleculen, zou antigeen-presentatie door tumorcellen ook kunnen leiden tot een onvolledige activatie van de killer-T-cellen. In hoofdstuk 4 laten we zien dat hoewel de tumorcellen zelf in de lymfeklier komen, ze niet in staat zijn zelf de tumor-specifieke T-cellen te activeren. In plaats daarvan zijn het cellen van de tumordragende muis zelf (de gastheer) die de tumor-antigenen presenteren aan de T-cellen. We laten zien dat de cellen die het tumor-antigeen presenteren aan de T-cellen zeer waarschijnlijk de zogenaamde dendritische cellen (DC) zijn. Omdat bij de groei van de tumor geen ontsteking plaatsvindt zijn de dendritische cellen in immature staat. Dat wil zeggen: ze hebben geen co-stimulatoire moleculen op hun oppervlak. Daardoor zullen de killer T-cellen die in aanraking komen met het tumor-antigeen op het oppervlak van de dendritische cel niet volledig geactiveerd worden. Door nu de tumor dragende muizen te behandelen met het antilichaam tegen CD40, worden de dendritische cellen in de muis geactiveerd. Hierdoor wordt een aantal co-stimulatoire moleculen op het oppervlak van de dendritische cellen verhoogd, en zullen de dendritische cellen stoffen uitscheiden die signalen kunnen doorgeven (cytokinen) waardoor de dendritische cellen beter in staat zijn de T-cellen volledig te activeren. Door deze betere activatie zullen de killer-T-cellen betere killer-functie krijgen, maar wat ook erg 


Hoofdstuk 5: Reacties van killer T-cellen na interactie met dendritische cellen 
Omdat dendritische cellen de cellen zijn die het tumorantigeen presenteren aan de T-cellen en activatie van deze cellen leidt tot afstoting van de tumoren, hebben we in hoofdstuk 5 onderzocht wat het directe effect van geïnjecteerde dendritische cellen op T-cellen is. De dendritische cellen werden voordat ze werden ingespoten, beladen met het E1A-tumorantigeen, dus ze presenteren het E1A-peptide op hun oppervlak. We hebben gekeken naar de T-cel respons na injectie van mature/geactiveerde dendritische cellen en immature dendritische cellen. T-cellen van muizen die de immature dendritische cellen kregen ingespoten gingen wel delen, maar hoopten zich niet op in het lymfesysteem van de muizen. Dit in tegenstelling tot T-cellen van muizen die werden ingespoten met gematureerde DC, die niet alleen deelden, maar ook ophoopten, en dus groter werden in aantal. Er leken geen functionele verschillen te bestaan tussen de T-cellen die een interactie hadden aangegaan met mature en immature dendritische cellen. Beide T-cel populaties waren even goed in staat doelwitcellen te doden. Wel werden er verschillen waargenomen in moleculen op het oppervlak van de T-cellen. Zo werden 2 moleculen die betrokken zijn bij het vasthouden van de T-cellen in de lymfeklier verlaagd tot expressie gebracht op de T-cellen die het E1A-antigeen hadden gezien in de context van geactiveerde dendritische cellen. Deze moleculen waren nog steeds in hoge concentraties aanwezig op het oppervlak van de T-cellen in de groep die met immature dendritische cellen was geïnjecteerd. Dit is een mogelijke verklaring voor het blijven steken van T-cellen in de lymfeklieren van tumordragende muizen die niet behandeld zijn, en het verspreiden van de T-cellen door het hele lichaam na activatie van de DC met het anti-CD40 antilichaam. 

Hoofdstuk 6: Het co-stimulatoire molecuul 4-1BB
Activatie van dendritische cellen is dus belangrijk voor het opwekken van een goede killer T-cel reactie die kan zorgdragen voor opruimen van tumoren. Een volgend belangrijk punt waarop afweerreacties door killer T-cellen beïnvloed kunnen worden is door kennis te ontwikkelen over welke co-stimulatoire signalen door een geactiveerde antigeen presenterende cel gegeven kunnen worden. Hoofdstuk 6 beschrijft het co-stimulatoire molecuul 4-1BB. 4-1BB kan worden gevonden op het oppervlak van geactiveerde T-cellen. Activatie van 4-1BB kan tumor-specifieke T-cellen activeren in afwezigheid van T-helpercellen (en dus van gematureerde antigeen presenterende cellen). De hoeveelheid 4-1BB op het oppervlak van T-cellen is afhankelijk van herkenning van antigeen door de T-cel en co-stimulatie door CD28. Als CD28 geblokkeerd wordt hebben de 4-1BB activerende antilichamen geen effect meer op de grootte en effectiviteit van killer T-cel responsen. Blijkbaar hebben antigeen presenterende cellen ook in immature toestand al voldoende CD28 op hun oppervlak om T-cellen te activeren tot expressie van 4-1BB. Na interactie van de T-cel met het antigeen op de antigeen presenterende cel in combinatie met co-stimulatie door CD28 kunnen de antilichamen tegen 4-1BB de verdere activatie van deze killer T-cellen bewerkstelligen (zie ook figuur 1 van hoofdstuk 9). Het activeren van 4-1BB lijkt de overleving van killer T-cellen te verbeteren, wat leidt tot een verhoogd aantal antigeenspecifieke T-cellen in de circulatie. Extra co-stimulatie via 4-1BB blijkt dus te kunnen zorgen voor activatie van killer T-cellen in situaties waar optimale omstandigheden voor de inductie van killer T-cel immuniteit ontbreken, zoals bijvoorbeeld in de situatie van een tumor.

Hoofdstuk 7: Tumorgroei gaat gepaard met de onwikkeling van cellen die de afweer tegen de tumor onderdrukken 
Voor goede activatie van killer-T-cellen zijn T-helpercellen nodig. Een belangrijk kenmerk van T-helpercellen is dat zij het molecuul CD4 op hun oppervlak hebben. Als tumorcellen in een muis zonder CD4+ cellen gespoten worden, worden geen killer T-cellen geactiveerd. Echter, zoals is te zien in hoofdstuk 7, wanneer de CD4+ T-cellen worden verwijderd wanneer de tumor al 25 dagen in de muis aanwezig is, ontstaat een effectieve killer-T-cel reactie tegen de groeiende tumor. Blijkbaar is tijdens de tumor-groei iets gebeurd met de CD4+ cellen, waardoor deze cellen de killer T-cel respons onderdrukken in plaats van activeren. Hoe dit precies in zijn werk gaat wordt niet in dit proefschrift beschreven. Om dit mechanisme te ontrafelen zijn meer experimenten nodig. De bevinding dat deze onderdrukking van de afweerreactie tegen tumorcellen kan worden overmand door toedienen van DC-activerende stoffen, is hoopgevend voor gebruik van deze middelen in mensen met kanker. Dit laat namelijk zien dat, ook al is het afweersysteem al beïnvloed door de groeiende tumor (bijvoorbeeld door het ontstaan van afweeronderdrukkende celtypen), toch nog een effectieve afweerreactie tegen de tumor kan worden opgewekt.

Hoofdstuk 8: Immunologisch geheugen na vaccinatie (inenting)
Een andere methode die zou kunnen worden toegepast om de groei van tumoren te voorkomen is het vaccineren van mensen met verhoogd risico op bepaalde tumoren. De basis van vaccinatie wordt gevormd door het immunologisch geheugen, dat het afweersysteem in staat stelt sneller, heftiger en efficiënter te reageren op lichaamsvreemde elementen die al eerder gezien zijn. In hoofdstuk 8 bekijken we of geheugencellen gevoelig zijn om getolerizeerd te worden. Injectie van het E1A-peptide leidt tot verwijning van de aanwezige naieve killer T-cellen die dit peptide herkennen, wat leidt tot versnelde uitgroei van de tumoren die het E1A-peptide op hun oppervlak dragen. Wanneer echter geheugencellen ontstaan zijn, als gevolg van een effectieve afweerrespons gericht tegen een vaccinatie met een geïnactiveerd virus, zullen tumorcellen die onderhuids worden ingespoten worden opgeruimd en vindt dus geen tumorgroei plaats. Omdat tumorgroei kan leiden tot tolerantie van T-cellen, wilden we onderzoeken of ook geheugencellen, ontstaan door virusvaccinatie, gevoelig zijn voor tolerantie. Het is eerder aangetoond dat het E1A-peptide tolerantie van T-cellen veroorzaakt doordat het peptide door het hele organisme verspreid aanwezig blijft. 

Kanker is een belangrijke doodsoorzaak en kan in veel gevallen nog niet genezen worden. Manipuleren van de afweer tegen kanker door middel van immunotherapie is mogelijk een goede manier om genezing van kanker te bevorderen. In dit proefschrift worden enkele mogelijkheden om een afweerreactie tegen tumoren te bewerken besproken. Hoewel nog verder onderzocht moet worden of de bevindingen zoals beschreven in dit proefschrift ook bij de mens kunnen worden toegepast, zal dit onderzoek in ieder geval een belangrijke bijdrage leveren aan de potentiële ontwikkeling van nieuwe behandelingen voor mensen met kanker. 

Summary:  

The work presented in this thesis was supported by the Dutch Cancer Society.

The immune system is an intricately regulated system, designed to protect the host against intruders, such as viruses and bacteria. Because it became clear that immuno-compromised individuals are more susceptible to both virus-induced cancers (1-3) and non-virally induced tumors (4-6), the assumption grew that immune surveillance by components of the immune system was responsible for suppression of tumor-growth in healthy individuals. The fact that the immune system thus is capable of killing neoplastic cells, has fuelled the idea that the immune system can specifically be activated and directed against tumors that escaped immune surveillance. As it has been shown that tumor cells that were rejected in immunocompetent mice, grew progressively in CD8+ T-cell depleted mice, CD8+ T-cells are probably a major effector subset of tumor-specific immunity (7). The research described in this thesis focused on the outcome of the interaction of the cells presenting the tumor-antigens and the CD8+ effector cells which should be activated to kill the tumor cells, and possible ways to interfere with this interaction to get a rigid anti-tumor immune response. Furthermore, attention is paid to the way intrinsic protection mechanisms against autoimmunity and immune responses in immune privileged sites can interfere with anti-tumor immunity. 

The dendritic cell (DC) is a cell that responds to its environment in several ways, and in turn influences several aspects of the immune response. It is activated by endogenous or exogenous danger signals to capture, process and present antigen along with co-stimulatory signals and hence initiates an immune response. It is also influenced by the cells, cytokines and other signals in its environment to modify the response so that it is appropriate for both the pathogen and the location in which it unfolds.
We have shown that tumor antigens in a model tumor, expressing the E1A-protein of human adenovirus type 5, injected subcutaneously (sc.), are presented to the immune system via cross-presentation in the tumor draining lymph node (DLN) only (chapter 2). The cell type responsible for antigen presentation is most likely a DC, as in vitro proliferation of E1A-specific transgenic T-cells was observed after isolation of CD11c+ cells out of the tumor DLN, whereas negligible proliferation was detected when the transgenic T-cells were incubated with the CD11c-negative fraction of the lymph node population.
Although being highly immunogenic, the E1A-expressing tumor grows progressively in immunocompetent mice. An ineffective cytotoxic T-lymphocyte (CTL) response is induced in these mice, which can only be visualized in the tumor DLN. It is conceivable that the abortive nature of the CTL response is due to deficient signaling by DC that have sampled and processed tumor antigen at the tumor site, and received insufficient maturation signals. This can be explained by the fact that tumor growth is not accompanied by inflammatory stimuli, leading to tolerance, or non-effective CTL responses (8). The role of CD4+ T helper cells in the induction of CTL responses has been studied extensively (9,10). Antigen presenting cells (APC), activated through interaction of CD40L on the CD4+ T helper cell with CD40 on the APC, can activate naïve CD8+ T-cells to become effector CTL. Targeting CD40 directly by means of activating antibodies can replace the need for T-cell help in CTL priming (11,12), and it is also effective in preventing peptide-induced peripheral CTL tolerance (13). We showed that after treatment of tumor bearing animals with an activating antibody directed against CD40, DC were activated, as shown by upregulation of costimulatory molecules like CD80 and CD86 (chapter 4). Indeed, this activated phenotype of the DC was strongly associated with an effective anti-tumor response leading to eradication of sc. growing tumors. T-cells in the tumor DLN can thus be activated by in vivo maturation of the DC. However, it is not known whether this leads to activation of tumor-specific T-cells that already interacted with immature DC, or that T-cells newly arriving out of the thymus in the periphery are activated by the maturated DC. Nonetheless, these findings clearly demonstrate the potential of using DC-activating agents to mobilize effective anti-tumor CTL responses. 
It has been shown by several groups that antigen presentation by immature DC can lead to anergy or tolerance induction (14-19), whereas encounter of antigen presented by mature/activated DC leads to full-blown effector function of the T-cells. As shown in the tumor model, the existing T-cells directed against the tumor antigen E1A are not completely tolerized or depleted from the periphery. Comparable results were obtained when immature DC from the DC-cell line D1 were injected. Injection of these cells into naïve mice resulted in a small but extant CTL-response against the peptide loaded on the immature D1 cells. The resulting CTL were capable of killing and in vivo restimulation of the CTL that had interacted with the antigen presented by the immature DC resulted in profound expansion of the CTL population (chapter 5). Thus, interaction with immature D1 cells did not lead to complete deletion or tolerance induction, leaving the T-cells in a state capable to react to a second encounter with their specific antigen. 
Although no real tolerance induction was evident after injection of immature D1 cells, some differences were observed after injection of immature versus mature D1 cells. One of the differences was accumulation of adoptively transferred transgenic T-cells, recognizing the E1A-peptide bound to the MHC class I on the D1 cells, after injection of in vitro maturated DC. Although comparable numbers of division cycles were observed after injection of immature DC loaded with the same peptide, no accumulation of the adoptively transferred T-cells was detected. It was verified that this was not only because of superior migration to the lymphoid organs and better antigen presentation of the mature DC compared to that of the immature DC, but rather a qualitative difference in signal delivered to the CD8+ T-cells. This was reasoned because the differences in accumulation profile were still observed after titration of the maturated DC to an amount that led to comparable numbers of T-cells responding to antigen-encounter (chapter 5). 
Another difference observed after systemic injection of immature versus mature D1-cells was the downregulation of CCR7 and CD62L in response to injection of mature D1 cells, which was not seen after injection of immature D1-cells (chapter 5). CD62L (L-selectin) and CCR7 are homing receptors, found on so-called central memory cells that are lost on effector cells. They are known to be involved in retaining T-lymphocytes in the lymphoid organs (20). Comparable results were expected in tumor bearing animals that were either left untreated or were treated with the agonistic anti-CD40 monoclonal antibody (mAb) to activate the antigen presenting DC. This could explain the confinement of tumor-specific CD8+ T-cells to the tumor DLN in untreated animals in contrast to the systemic spread of the T-cells after CD40 ligation (chapter 2). However, downregulation of the expression levels of CD62L and CCR7 were not observed in the lymphoid organs of mice treated with the agonistic anti-CD40 mAb, but a slight downregulation of these molecules was observed in tumor DLNs of untreated tumor bearing animals. Probably this difference in outcome between the two model systems can be explained by the fact that tumor antigens are present in the periphery which results in departure of the properly activated T-cells out of the lymph node searching for their specific antigen. It is conceivable that the CTL that have down-modulated their CD62L and CCR7 expression have left the tumor DLN and can be found back in the blood and tumor tissue after having down-modulated their CD62L and CCR7 expression. 

In several organs of the body T-cell immunity is actively suppressed, to protect immunologically vulnerable structures. For instance, maintenance of the precise microanatomy of the eye is essential for its physiological function. Inflammatory responses can lead to loss of vision. As loss of sight is a powerful negative-selecting force, the benefits of ocular immune privilege outweigh the risks. Different mechanisms contribute to the immune privilege of the eye, such as the blood-aqueous-barrier which impairs the entry of immune cells into the eye. Also, the intraocular tissues express CD95-ligand, a molecule capable of inducing apoptosis of CD95+ CTL and other CD95+ inflammatory cells (21,22). Another important mechanism of immune privilege of the eye is a phenomenon called anterior chamber acquired immune deviation (ACAID), describing that inoculation of antigen into the anterior chamber (AC) can generate systemic tolerance. ACAID is thought to be induced by eye-derived APC which drain via the major outflow pathway of the eye directly into the blood to the spleen where the intraocular antigen is presented (23-25). Because the eye-derived APC have been exposed to various immune modulatory cytokines present in the eye, such as TGF-b and IL-10, they are thought to induce regulatory (NK) T-cell circuits, which subsequently suppress delayed-type hypersensitivity responses.
In the model in which the E1A-expressing tumor grows in the AC of the eye, the immune privilege of the eye influences the outcome of the anti-tumor CTL responses. The eye protects itself against anti-tumor immunity in at least two different ways. As we showed in chapter 3, comparable to the model in which the tumor is injected sc., in the AC tumor model the E1A-antigen is presented to the T-cells in the tumor DLN only, resulting in detectable numbers of tumor-specific CD8+ T-cells that are confined to the tumor DLN. In this model, treatment with the anti-CD40 mAb did not lead to systemic spread of the tumor-specific CD8+ T-cells, as we observed in the sc. growing tumor model. A possible explanation for these observations is that the APC presenting the tumor antigen in the DLN of the AC tumors were modulated by cytokines in the eye, such as IL-10 and TGF-b, leading to a different activation pathway after CD40 signaling (26). For example, it has been shown that bone marrow derived DC treated with IL-10 were unable to acquire the ability to stimulate naïve T-cells in an allogenic mixed leukocyte reaction, even following the addition of LPS (27). Also, the surface molecules CD80, CD86, and MHC class II were not upregulated on IL-10 treated DC following LPS-exposure (27). Furthermore, maturation via CD40 activation is partially, but not completely, blocked by pre-treatment of DC with IL-10 (28). It would be interesting to investigate the effect of anti-CD40 treatment on the activation status of DC presenting the tumor-derived antigens in the tumor DLNs of mice bearing an AC tumor. 
Mice bearing a tumor in the AC of the eye experience suppressed systemic immunity against the specific tumor-antigen, as shown by the progressive growth of sc. tumors in mice bearing an eye-tumor whereas those tumors do not grow sc. in mice not bearing an AC-tumor. This systemic tolerance can be overcome by treatment of the mice bearing both an AC-tumor and a sc. growing tumor, with the agonistic CD40 mAb (chapter 3, figure 9). This treatment leads to eradication of the sc. growing tumors, suggesting that the T-cells present in the periphery can still be activated by properly activated DC. Although tumors growing sc. are eradicated after anti-CD40 mAb treatment, this treatment does not have any effect on the growth of the AC-growing tumors, indicating that also local factors in the eye, rather than systemic effects prevent AC-tumor elimination. This underlines another barrier for immune privilege of the eye. 

The observation that for sc. growing tumors local injection of anti-CD40 mAb results in a strong systemic anti-tumor effect is highly relevant with respect to possible clinical application of DC-activating agents. Because local anti-CD40 treatment leads to systemic immunity capable of eradicating distal tumors or metastasis, employment of CD40 stimulating agents appears particularly attractive in combination with surgical resection of primary tumors. In a setting in which CD40 activating agents are injected 1 or 2 weeks before surgery, the immune system could be (re)activated, allowing detection and clearance of potential undetected metastases. Also, migration out of the tumor DLN by tumor-specific CTL would allow surgical removal of lymph nodes without the dangerous side-effect of removing the main, if not only, source of tumoricidal CTL precursors. In addition to clearance of the sc. growing tumor after anti-CD40 treatment, immunological memory has developed, as is indicated by induction of an effective anti-tumor response in case of rechallenge with the same tumor. This might contribute to the prevention of tumor-relapse. Another advantage of the use of CD40 stimulating agents in the clinical setting is the fact that no insight in the tumor antigens involved is necessary. Based on the observations described in this thesis, this modality seems particularly promising for the treatment of highly antigenic tumors that fail to mobilize CTL immunity due to the lack of sufficient inflammatory signals, such as for example HPV-positive cervical carcinomas (29,30).
A major hazard of the general stimulation of CD40 might be the induction of autoimmunity in the host. As can be imagined, not only tumor-antigens are presented by the activated DC, but also presentation of self-antigens will be accomplished by activated DC, leading to the possible priming instead of tolerization of self-specific T-cells. Although this is an important aspect, we did not analyze this in detail. What we observed however was that after a second i.v. injection of the anti-CD40 mAb two weeks after a first i.v. injection, a shock-like syndrome was induced in all mice, resulting in 50% mortality. This was probably a consequence of the induction of a cytokine burst of CD40 positive cells, including B-cells. This toxic effect was not observed after repeated local (peritumoral, sc.) injection of the anti-CD40 mAb, indicating that local anti-CD40 treatment is to be preferred over systemic injection. With local treatment we did not notice any side effects. Nonetheless, it will be important to map the possible risk of autoimmunity before anti-CD40 can be used in the clinical setting. 

Although CD4+ T-cells are necessary to bring forth a tumor-specific CD8+ T-cell response in a prophylactic setting, in case of an established sc. growing tumor CD4+ T-cells seem to have developed into cells which instead of activating the anti-tumor CTL response play a suppressive role in CD8+ T-cell induction (chapter 7). In a prophylactic vaccination protocol CD4+ T-cells were necessary for protection against subsequent tumor challenge. However, rapidly after tumor inoculation the CD4+ T-cells seem to have evolved into suppressing T-lymphocytes as depletion of CD4+ T-cells led to systemic spread of significant amounts of tumor-specific CTL capable to eradicate a sc. growing tumor. As we showed that depletion of CD25+ cells did not lead to the conversion of tumor tolerance into tumor immunity, probably the naturally occurring CD4+CD25+ regulatory T-cells, which are produced in the thymus as a functionally distinct subpopulation of T-cell (31) are not responsible for the suppressive effect on anti-tumor immune responses. The evolution of a suppressive effect of CD4+ T-cells might be explained by the fact that, the CD4+ T-cells encounter their specific tumor antigen in absence of any danger signals, leading to a class of alternatively activated or anergized tumor specific CD4+ T cells. It has been shown before that tumor growth induces antigen specific anergy of CD4+ T-cells at an early stage of tumor growth. Isolated transgenic CD4+ T-cells from A20HA tumor bearing hosts were not able to secrete IFN-g or IL-2 and did not proliferate in response to cognate peptide-pulsed APC (32). As anergic T-cells produce IL-10, this might suppress the activation of other T-cells (33). 
We did not investigate the cell type responsible for antigen presentation to tumor-specific CD4+ T-cells, but it is most likely that the same CD11c+ cells responsible for antigen presentation to CD8+ T-cells also present the antigen to tumor specific CD4+ T-cells. It has been shown that repetitive stimulation with immature DC leads to irreversibly reduced proliferation, and loss of IFN-g, IL-2 and IL-4 production of alloreactive T-cells (34). These T-cells could in vitro inhibit the antigen-driven proliferation of Th1 cells, in a contact dependent but antigen-nonspecific manner.
Different types of CD4+ T-cells with regulatory or suppressive function exist, all with different manners to suppress immune responses. The suppressive cells might act via cytokine secretion (IL-10, TGF-b) (35,36), T-cell – T-cell contact (37) or via T-cell – APC contact (reviewed in 38). Certain subsets of regulatory CD4+ T-cells act directly on DC rendering them tolerogenic. For example, CD4+CD25+ anergic cells were shown to act directly on APC in a cytokine independent manner, inducing the upregulation of the inhibitory receptors ILT3 and ILT4. These inhibitory receptors were crucial to the tolerogenic phenotype acquired by APC, since the suppressive effect of the regulatory T-cells was abrogated by blockade of ILT3 and ILT4. APC tolerized by anergic CD4+CD25+ Treg cells may inhibit the alloreactivity of other CD4+ Thelper cells, or of CD8+ T-cells (38). The type of CD4+ T-cell responsible for the suppression of the anti-tumor CTL response, and the nature of suppression should be further investigated. 
Administration of DC-activating agents did overcome the suppressive effect of the CD4+ T-cells in mice bearing an established tumor. This might be explained by the reversal of suppressive capability of the CD4+ T-cells, as was shown for CD4+CD25+ T-cells after ligation of toll-like receptors (39,40). Another possibility would be that the CTL-priming capacity of the DC presenting the tumor antigens to CD8+ T-cells by administraton of the DC-activating agents is sufficient enhanced to overcome the suppressive action of the evolved CD4-response (chapter 4). 

Activation of DC by the anti-CD40 mAb leads to upregulation of 4-1BB ligand (4-1BBL) (chapter 6). It has been shown that 4-1BBL-triggering on DC leads to IL-12 production (41). Also, in vivo CD40-ligation led to increased IL-12 production by CD11c+ cells (our unpublished observations and ref 42), which is probably one of the factors responsible for the enhanced T-cell priming capacity of DC after CD40-triggering. Futagawa et. al. found partial inhibition of IL-12 production by CD40-activated DC by blocking 4-1BB in DC-cultures (43). This indicates that the 4-1BB – 4-1BBL interactions are at least partly involved in the CD40-mediated IL-12 production by DC. Miller et. al. observed eradicaton of tumors after treatment of mice with anti-4-1BB mAb (44). This anti-tumor immunity however was effectively inhibited by blocking CD40L, indicating that a CD40 mediated signal is required for clonal expansion and attainment of effector function. The exact cooperation between these two receptor/ligand systems should be further investigated. An attractive hypothesis is that CD40 triggers DC to upregulate 4-1BBL which subsequently gives a survival signal to CTL, preventing T-cell death after initial activation.
On T-cells, 4-1BB is only expressed after TCR-triggering. Therefore, costimulation by 4-1BBL will only stimulate those T-cells that have recognized their antigen. Signaling through 4-1BB can as efficiently as CD40 triggering revert peptide-induced peripheral CTL tolerance into immunity (chapter 6). Also, 4-1BB triggering is sufficient to prime anti-tumor CTL after tumor cell vaccination in the absence of CD4+ T-helper cells. Blocking the interaction between 4-1BB and 4-1BBL led to inhibition of CTL-priming, but priming was not abolished, suggesting that 4-1BB signaling was not absolutely required in cross-priming of CTL. This is supported by the fact that also in 4-1BBL knock out mice CTL priming is only diminished but not abolished (45-47). In various mouse tumor models in vivo 4-1BB-ligation was successfully used in tumor therapy (48-50). Also in the E1A-expressing tumor model tumor eradication was observed after treatment of mice with anti-4-1BB mAb. As we observed in chapter 2, a weak anti-tumor response is induced in absence of any treatment. As primed, but not naïve CD8+ T-cells express 4-1BB, injection of an anti-4-1BB mAb then provides a strong amplification signal for these primed T-cells (49). However, another explanation might be found in the fact that also DC express 4-1BB (43,51). It has been shown that ligation of 4-1BB on DC, by co-culture with 4-1BBL expressing tumor cells, leads to cytokine production (IL-12 and IL-6), and upregulation of co-stimulatory molecules like CD80/CD86 (43), and to better ability of the DC to stimulate T-cell proliferation in vitro (51). 
Upregulation of 4-1BB on T-cells after activation is dependent on CD28 costimulation. Also in the presence of CD4+ T-cells, blockade of B7/CD28 interactions led to complete inhibition of the priming effects of anti-4-1BB antibodies (chapter 6). Even in the absence of CD4+ T-helper cells, and thus absence of activated APC, CTLA-4 Ig could completely inhibit the priming effects of anti-4-1BB antibodies. This implies that immature APC are capable of such levels of TCR-triggering and CD28-signalling, to upregulate 4-1BB on naïve T-cells, enabling costimulation through 4-1BB.

Many obstacles in the development of cancer immunotherapy still exist. It has become clear that even though effector CTL may be efficiently induced, it is also important for those cells to be capable of reaching the site of tumor growth, as immune privileged sites, for example the eye, exist which are difficult to reach. Also, it has been shown in a murine tumor model expressing OVA that tumor-antigen was efficiently cross-presented leading to potent, specific CTL. Despite the presence of these activated CTL, tumor growth was not prevented, indicating that the failure to prevent tumor growth is not in the induction phase, but in the effector phase, and occurs within the tumor itself (52). The exploitation of activating CD40 and 4-1BB agents can be successful for the efficient induction of CTL without the need of CD4+ T-helper cells and even overcome the suppressive effect of regulatory T-cells. However, the effects of costimulation through CD40 and 4-1BB on the immunosuppressive properties of regulatory T-cells should still be addressed. Nonetheless, targeting such molecules in for example an adjuvant setting after surgery or irradiation is a highly promising path to follow, possibly leading to implementation of therapies aiming at activation of these members of the TNF-receptor family into the established arrays of treatment modalities. 


References

1. Klein, G. 1991. Immunovirology of transforming viruses. Curr.Opin.Immunol. 3:665-673.
2. Petry, K. U., D. Scheffel, U. Bode, T. Gabrysiak, H. Kochel, E. Kupsch, M. Glaubitz, S. Niesert, H. Kuhnle, and I. Schedel. 1994. Cellular immunodeficiency enhances the progression of human papillomavirus-associated cervical lesions. Int.J.Cancer 57:836-840.
3. Shamanin, V., M. Glover, C. Rausch, C. Proby, I. M. Leigh, H. H. zur, and E. M. de Villiers. 1994. Specific types of human papillomavirus found in benign proliferations and carcinomas of the skin in immunosuppressed patients. Cancer Res. 54:4610-4613.
4. Birkeland, S. A. 1997. De novo cancers complicating renal transplantation: experience in the Nordic countries. Ann.Transplant. 2:22-26.
5. Shankaran, V., H. Ikeda, A. T. Bruce, J. M. White, P. E. Swanson, L. J. Old, and R. D. Schreiber. 2001. IFNgamma and lymphocytes prevent primary tumour development and shape tumour immunogenicity. Nature 410:1107-1111.
6. Wiedenfeld, E. A., M. Fernandez-Vina, J. A. Berzofsky, and D. P. Carbone. 1994. Evidence for selection against human lung cancers bearing p53 missense mutations which occur within the HLA A*0201 peptide consensus motif. Cancer Res. 54:1175-1177.
7. Fan, S. T. and T. S. Edgington. 1989. Sufficiency of the CD8+ T cell lineage to mount an effective tumoricidal response to syngeneic tumor-bearing novel class I MHC antigens. J.Immunol. 143:4287-4291.
8. Melief, C. J., S. H. van der Burg, R. E. Toes, F. Ossendorp, and R. Offringa. 2002. Effective therapeutic anticancer vaccines based on precision guiding of cytolytic T lymphocytes. Immunol.Rev. 188:177-182.
9. Keene, J. A. and J. Forman. 1982. Helper activity is required for the in vivo generation of cytotoxic T lymphocytes. J.Exp.Med. 155:768-782.
10. Mitchison, N. A. and C. O'Malley. 1987. Three-cell-type clusters of T cells with antigen-presenting cells best explain the epitope linkage and noncognate requirements of the in vivo cytolytic response. Eur.J.Immunol. 17:1579-1583.
11. Bennett, S. R., F. R. Carbone, F. Karamalis, R. A. Flavell, J. F. Miller, and W. R. Heath. 1998. Help for cytotoxic-T-cell responses is mediated by CD40 signalling. Nature 393:478-480.
12. Schoenberger, S. P., R. E. Toes, E. I. van der Voort, R. Offringa, and C. J. Melief. 1998. T-cell help for cytotoxic T lymphocytes is mediated by CD40-CD40L interactions. Nature 393:480-483.
13. Diehl, L., A. T. den Boer, S. P. Schoenberger, E. I. van der Voort, T. N. Schumacher, C. J. Melief, R. Offringa, and R. E. Toes. 1999. CD40 activation in vivo overcomes peptide-induced peripheral cytotoxic T-lymphocyte tolerance and augments anti-tumor vaccine efficacy. Nat.Med. 5:774-779.
14. Heath, W. R. and F. R. Carbone. 2001. Cross-presentation, dendritic cells, tolerance and immunity. Annu.Rev.Immunol. 19:47-64.
15. Hernandez, J., S. Aung, W. L. Redmond, and L. A. Sherman. 2001. Phenotypic and functional analysis of CD8(+) T cells undergoing peripheral deletion in response to cross-presentation of self-antigen. J.Exp.Med. 194:707-717.
16. Kurts, C., H. Kosaka, F. R. Carbone, J. F. Miller, and W. R. Heath. 1997. Class I-restricted cross-presentation of exogenous self-antigens leads to deletion of autoreactive CD8(+) T cells. J.Exp.Med. 186:239-245.
17. Ohlen, C., M. Kalos, L. E. Cheng, A. C. Shur, D. J. Hong, B. D. Carson, N. C. Kokot, C. G. Lerner, B. D. Sather, E. S. Huseby, and P. D. Greenberg. 2002. CD8(+) T cell tolerance to a tumor-associated antigen is maintained at the level of expansion rather than effector function. J.Exp.Med. 195:1407-1418.
18. Schuurhuis, D. H., S. Laban, R. E. Toes, P. Ricciardi-Castagnoli, M. J. Kleijmeer, E. I. van der Voort, D. Rea, R. Offringa, H. J. Geuze, C. J. Melief, and F. Ossendorp. 2000. Immature dendritic cells acquire CD8(+) cytotoxic T lymphocyte priming capacity upon activation by T helper cell-independent or -dependent stimuli. J.Exp.Med. 192:145-150.
19. Steinman, R. M., S. Turley, I. Mellman, and K. Inaba. 2000. The induction of tolerance by dendritic cells that have captured apoptotic cells. J.Exp.Med. 191:411-416.
20. Kaech, S. M., E. J. Wherry, and R. Ahmed. 2002. Effector and memory T-cell differentiation: implications for vaccine development. Nat.Rev.Immunol. 2:251-262.
21. Griffith, T. S., T. Brunner, S. M. Fletcher, D. R. Green, and T. A. Ferguson. 1995. Fas ligand-induced apoptosis as a mechanism of immune privilege. Science 270:1189-1192.
22. Sano, Y. and C. Sotozono. 2002. Role of Fas ligand in ocular tissue. Cornea 21:S30-S32.
23. Wilbanks, G. A. and J. W. Streilein. 1990. Characterization of suppressor cells in anterior chamber-associated immune deviation (ACAID) induced by soluble antigen. Evidence of two functionally and phenotypically distinct T-suppressor cell populations. Immunology 71:383-389.
24. Wilbanks, G. A., M. Mammolenti, and J. W. Streilein. 1991. Studies on the induction of anterior chamber-associated immune deviation (ACAID). II. Eye-derived cells participate in generating blood-borne signals that induce ACAID. J.Immunol. 146:3018-3024.
25. Wilbanks, G. A. and J. W. Streilein. 1991. Studies on the induction of anterior chamber-associated immune deviation (ACAID). 1. Evidence that an antigen-specific, ACAID-inducing, cell-associated signal exists in the peripheral blood. J.Immunol. 146:2610-2617.
26. Rea, D., C. van Kooten, K. E. van Meijgaarden, T. H. Ottenhoff, C. J. Melief, and R. Offringa. 2000. Glucocorticoids transform CD40-triggering of dendritic cells into an alternative activation pathway resulting in antigen-presenting cells that secrete IL-10. Blood 95:3162-3167.
27. Nolan, K. F., V. Strong, D. Soler, P. J. Fairchild, S. P. Cobbold, R. Croxton, J. A. Gonzalo, A. Rubio, M. Wells, and H. Waldmann. 2004. IL-10-conditioned dendritic cells, decommissioned for recruitment of adaptive immunity, elicit innate inflammatory gene products in response to danger signals. J.Immunol. 172:2201-2209.
28. Woltman, A. M. and C. van Kooten. 2003. Functional modulation of dendritic cells to suppress adaptive immune responses. J.Leukoc.Biol. 73:428-441.
29. Melief, C. J., R. E. Toes, J. P. Medema, S. H. van der Burg, F. Ossendorp, and R. Offringa. 2000. Strategies for immunotherapy of cancer. Adv.Immunol. 75:235-282.
30. zur, Hausen. H. 2000. Papillomaviruses causing cancer: evasion from host-cell control in early events in carcinogenesis. J.Natl.Cancer Inst. 92:690-698.
31. Sakaguchi, S., N. Sakaguchi, M. Asano, M. Itoh, and M. Toda. 1995. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. J.Immunol. 155:1151-1164.
32. Staveley-O'Carroll, K., E. Sotomayor, J. Montgomery, I. Borrello, L. Hwang, S. Fein, D. Pardoll, and H. Levitsky. 1998. Induction of antigen-specific T cell anergy: An early event in the course of tumor progression. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 95:1178-1183.
33. Buer, J., A. Lanoue, A. Franzke, C. Garcia, H. von Boehmer, and A. Sarukhan. 1998. Interleukin 10 secretion and impaired effector function of major histocompatibility complex class II-restricted T cells anergized in vivo. J.Exp.Med. 187:177-183.
34. Jonuleit, H., E. Schmitt, G. Schuler, J. Knop, and A. H. Enk. 2000. Induction of interleukin 10-producing, nonproliferating CD4(+) T cells with regulatory properties by repetitive stimulation with allogeneic immature human dendritic cells. J.Exp.Med. 192:1213-1222.
35. Groux, H. 2001. An overview of regulatory T cells. Microbes.Infect. 3:883-889.
36. Wahl, S. M., J. Swisher, N. McCartney-Francis, and W. Chen. 2004. TGF-{beta}: the perpetrator of immune suppression by regulatory T cells and suicidal T cells. J.Leukoc.Biol. 76:15-24.
37. Taylor, P. A., T. M. Friedman, R. Korngold, R. J. Noelle, and B. R. Blazar. 2002. Tolerance induction of alloreactive T cells via ex vivo blockade of the CD40:CD40L costimulatory pathway results in the generation of a potent immune regulatory cell. Blood 99:4601-4609.
38. Suciu-Foca, N., J. S. Manavalan, and R. Cortesini. 2003. Generation and function of antigen-specific suppressor and regulatory T cells. Transpl.Immunol. 11:235-244.
39. Pasare, C. and R. Medzhitov. 2003. Toll pathway-dependent blockade of CD4+CD25+ T cell-mediated suppression by dendritic cells. Science 299:1033-1036.
40. Yang, Y., C. T. Huang, X. Huang, and D. M. Pardoll. 2004. Persistent Toll-like receptor signals are required for reversal of regulatory T cell-mediated CD8 tolerance. Nat.Immunol. 5:508-515.
41. Laderach, D., A. Wesa, and A. Galy. 2003. 4-1BB-ligand is regulated on human dendritic cells and induces the production of IL-12. Cell Immunol. 226:37-44.
42. Cella, M., D. Scheidegger, K. Palmer-Lehmann, P. Lane, A. Lanzavecchia, and G. Alber. 1996. Ligation of CD40 on dendritic cells triggers production of high levels of interleukin-12 and enhances T cell stimulatory capacity: T-T help via APC activation. J.Exp.Med. 184:747-752.
43. Futagawa, T., H. Akiba, T. Kodama, K. Takeda, Y. Hosoda, H. Yagita, and K. Okumura. 2002. Expression and function of 4-1BB and 4-1BB ligand on murine dendritic cells. Int.Immunol. 14:275-286.
44. Miller, R. E., J. Jones, T. Le, J. Whitmore, N. Boiani, B. Gliniak, and D. H. Lynch. 2002. 4-1BB-specific monoclonal antibody promotes the generation of tumor-specific immune responses by direct activation of CD8 T cells in a CD40-dependent manner. J.Immunol. 169:1792-1800.
45. DeBenedette, M. A., T. Wen, M. F. Bachmann, P. S. Ohashi, B. H. Barber, K. L. Stocking, J. J. Peschon, and T. H. Watts. 1999. Analysis of 4-1BB ligand (4-1BBL)-deficient mice and of mice lacking both 4-1BBL and CD28 reveals a role for 4-1BBL in skin allograft rejection and in the cytotoxic T cell response to influenza virus. J.Immunol. 163:4833-4841.
46. Tan, J. T., J. K. Whitmire, R. Ahmed, T. C. Pearson, and C. P. Larsen. 1999. 4-1BB ligand, a member of the TNF family, is important for the generation of antiviral CD8 T cell responses. J.Immunol. 163:4859-4868.
47. Tan, J. T., J. K. Whitmire, K. Murali-Krishna, R. Ahmed, J. D. Altman, R. S. Mittler, A. Sette, T. C. Pearson, and C. P. Larsen. 2000. 4-1BB costimulation is required for protective anti-viral immunity after peptide vaccination. J.Immunol. 164:2320-2325.
48. Kim, J. A., B. J. Averbook, K. Chambers, K. Rothchild, J. Kjaergaard, R. Papay, and S. Shu. 2001. Divergent effects of 4-1BB antibodies on antitumor immunity and on tumor-reactive T-cell generation. Cancer Res. 61:2031-2037.
49. Melero, I., W. W. Shuford, S. A. Newby, A. Aruffo, J. A. Ledbetter, K. E. Hellstrom, R. S. Mittler, and L. Chen. 1997. Monoclonal antibodies against the 4-1BB T-cell activation molecule eradicate established tumors. Nat.Med. 3:682-685.
50. Ye, Z., I. Hellstrom, M. Hayden-Ledbetter, A. Dahlin, J. A. Ledbetter, and K. E. Hellstrom. 2002. Gene therapy for cancer using single-chain Fv fragments specific for 4-1BB. Nat.Med. 8:343-348.
51. Wilcox, R. A., A. I. Chapoval, K. S. Gorski, M. Otsuji, T. Shin, D. B. Flies, K. Tamada, R. S. Mittler, H. Tsuchiya, D. M. Pardoll, and L. Chen. 2002. Cutting edge: Expression of functional CD137 receptor by dendritic cells. J.Immunol. 168:4262-4267.
52. Nelson, D. J., S. Mukherjee, C. Bundell, S. Fisher, D. van Hagen, and B. Robinson. 2001. Tumor progression despite efficient tumor antigen cross-presentation and effective "arming" of tumor antigen-specific CTL. J.Immunol. 166:5557-5566.