Algemeen > nieuws > promoties

Promoties Geneeskunde

Korte samenvatting:

Bij sommige mensen lokken eiwitten in granen een afweerreactie in de dunne darm uit. Deze ziekte, coeliakie, ontstaat op de kinderleeftijd. Patiënten moeten levenslang een dieet volgen waarin producten van tarwe, gerst en rogge ontbreken.

Willemijn Vader denkt dat de ziekte misschien te voorkomen is. De aanleg voor coeliakie is erfelijk bepaald, maar niet iedereen die de aanleg heeft ontwikkelt de ziekte. Wellicht zijn problemen te vermijden door baby’s te screenen en bij de kinderen die een erfelijke aanleg voor coeliakie hebben de hoeveelheid granen in het dieet heel langzaam op te voeren.

Samenvatting

Coeliakie (spreek uit:seuliakie )is een ziektebeeld dat wordt veroorzaakt door intolerantie voor gluteneiwitten afkomstig uit tarwe.Dit graan is een belangrijk bestanddeel van onze voeding,want het is de basis van brood,pasta en koekjes en in een groot aantal andere producten wordt tarwemeel verwerkt.Coeliakie patiënten hebben last van buikpijn,diarree,vermoeidheid;kinderen vertonen vaak een vertraagde groei en op latere leeftijd hebben de patiënten een verhoogde kans op onvruchtbaarheid, botontkalking en sommige vormen van kanker.Deze symptomen zijn het gevolg van een chronische ontsteking in de dunne darm van de patiënten door het eten van gluten.

Geschiedenis
Al aan het eind van de 19de eeuw hebben artsen een aandoening beschreven met de hierboven genoemde typische symptomen,waaraan later de naam van coeliakie werd verbonden (coeliac betekent van de buik ).Pas rond 1950 heeft de Nederlandse arts W.K.Dicke de oorzaak van de ziekte gevonden.Hij constateerde dat de toestand van een aantal van zijn patiënten was verbeterd in de periodes van voedselschaarste tijdens de Tweede Wereldoorlog (1940 –1945).In tegenstelling tot de rest van de bevolking verslechterde de gezondheid van deze mensen weer toen zij hun normale voedingspatroon konden hervatten.Volgens Dicke was dit te wijten aan graaneiwitten in het dieet.Inderdaad kon hij dit enige jaren later bewijzen door observatie van een aantal patiënten die gestandaardiseerde diëten kregen voorgeschreven,afwisselend met en zonder toevoeging van tarwe.

Diagnose &behandeling
De diagnose coeliakie wordt gesteld aan de hand van een biopsie uit de dunne darm. Hiervoor wordt met behulp van een endoscoop,een flexibele buis die via de mond, slokdarm en maag de dunne darm kan bereiken,een stukje weefsel afgenomen. Bestudering van dit biopt onder de microscoop kan vervolgens aantonen of er sprake is van de weefselschade die typerend is voor coeliakie.In een gezonde darm bestaat de darmwand namelijk uit villi (weefselplooien),die het oppervlak van de darm sterk vergroten voor opname van voedingsstoffen.Door het ontstekingproces in de darm zijn bij coeliakie de villi aangetast of helemaal verdwenen.Hierdoor kunnen de voedingsstoffen dus minder goed opgenomen worden en ontstaan de karakteristieke symptomen van coeliakie.Wanneer het darmbiopt de kenmerken van de ziekte vertoont,zal de patiënt geadviseerd worden om een glutenvrij dieet te gaan volgen.Als dit vervolgens leidt tot verbetering van de gezondheid van de patiënt en het herstel van de schade in de darm,is dit vaak voldoende om de diagnose coeliakie te bevestigen.Een arts kan hierna nog besluiten tot een glutenbelasting om te kijken of de specifieke klachten inderdaad terugkomen en dus veroorzaakt worden door gluten.Deze laatste stap wordt echter vaak uit ethisch oogpunt achterwege gelaten.Vooralsnog bestaat de enige mogelijkheid voor behandeling van de ziekte uit het levenslang volgen van een glutenvrij dieet.Op die manier blijft het grootste deel van de patiënten klachtenvrij,maar het is een lastig dieet dat grote nauwkeurigheid vereist bij de keuze van voedingsproducten.

De darm &orale tolerantie
De darm heeft een complex afweersysteem dat ervoor moet zorgen dat het lichaam beschermd wordt tegen ziekteverwekkers,maar tegelijkertijd moet de voeding (ook een lichaamsvreemde stof )ongestoord verteerd kunnen worden.De werking van dit systeem is voor een groot deel nog onbekend,maar verstoring ervan kan leiden tot het optreden van infecties,voedselallergieën of -intoleranties.Bij coeliakiepatiënten wordt er een ongewenste afweerreactie opgewekt door gluteneiwitten uit de voeding, waardoor een permanente glutenintolerantie ontstaat.De kans op het ontstaan van de ziekte is onder andere afhankelijk van het moment van de eerste introductie van gluten in het dieet en van de hoeveelheid gluten.Dit werd opgemerkt in de jaren tachtig in Zweden,toen de hoeveelheid gluten in producten voor jonge kinderen werd verhoogd.Deze verandering in het dieet ging gepaard met een grote toename van het aantal ziektegevallen.Hieruit blijkt dat het immuunsysteem in de darm van jonge kinderen nog niet optimaal functioneert,zodat ze kwetsbaar zijn voor het ontwikkelen van voedingsgerelateerde ziekten.

Vier belangrijke factoren bij coeliakie
Gluten.Gluten zijn de opslageiwitten in tarwe.De gluteneiwitten kunnen op basis van biochemische eigenschappen worden onderverdeeld in twee belangrijke groepen, de gliadines en de glutenines.De unieke structuur van deze eiwitten veroorzaakt de karakteristieke elastische eigenschappen van tarwedeeg.Andere granen zoals gerst, rogge en haver hebben vergelijkbare opslageiwitten,respectievelijk hordeïnes,secalines en avenines.Bij coeliakiepatiënten veroorzaken rogge en gerst vergelijkbare symptomen,terwijl haver voor de meeste patiënten geen problemen oplevert. hla-dq 2.In het afweersysteem van mensen speelt een groot aantal verschillende hla - eiwitten een belangrijke rol.Ieder individu heeft een eigen combinatie van deze hla - eiwitten,die zich bevinden zich op het oppervlak van cellen in het lichaam.De rol van hla -eiwitten is om kleine stukjes van allerlei eiwitten (peptiden)te presenteren aan het immuunsysteem.Deze peptiden kunnen afkomstig zijn van onschadelijke eiwitten (bijvoorbeeld lichaamseigen of uit voeding),of van eiwitten van ziekteverwekkers. In het laatste geval moeten de surveillerende cellen van het immuunsysteem aangezet worden tot vernietiging van de indringer en komt er een afweerreactie op gang.Al geruime tijd is bekend dat het overgrote deel van de coeliakiepatiënten (>95%)één van die hla -eiwitten gemeenschappelijk heeft,namelijk hla-dq 2.Dit wijst erop dat de aanwezigheid van het hla-dq 2-eiwit een voorwaarde is om de ziekte te ontwikkelen. Het betekent echter niet dat iedereen die hla-dq 2 bezit ook daadwerkelijk de ziekte krijgt.Integendeel,ongeveer een kwart van de bevolking heeft hla-dq 2,terwijl 1 op de 300 personen coeliakie ontwikkelt. Gluten specifieke T-cellen.De cellen van het afweersysteem die reageren met glutenpeptiden worden glutenspecifieke T-cellen genoemd.De T-cellen herkennen bepaalde glutenpeptiden die gepresenteerd worden door hla-dq 2-eiwitten aan de buitenkant van cellen.De glutenspecifieke T-cellen zijn aanwezig in de darm van coeliakiepatiënten,maar worden niet gevonden in de darm van gezonde personen. Bij coeliakiepatiënten is er dus een ongewenste afweerreactie ontstaan tegen eiwitten uit de voeding,die leidt tot een chronische ontsteking zolang de patiënt gluten bevattende producten eet.Als een patiënt vervolgens overgaat op een glutenvrij dieet worden de glutenspecifieke T-cellen minder actief,maar ze verdwijnen niet. De patiënt is definitief intolerant voor gluteneiwitten en moet daarom levenslang een glutenvrij dieet volgen.De glutenpeptiden waarop de glutenspecifieke T-cellen reageren zijn afkomstig uit (verteerde)grotere gluteneiwitten.Om erachter te komen wat tarwe schadelijk maakt voor coeliakiepatiënten is het daarom van belang dat de glutenpeptiden die een T-cel reactie veroorzaken,worden geïdentificeerd. Voor onze experimenten worden glutenspecifieke T-cellen geïsoleerd uit darmbiopten van patiënten en vervolgens vermenigvuldigd door middel van bepaalde kweekmethoden.In de standaard testprocedure worden de T-cellen gestimuleerd met gluten.Als de gluteneiwitten worden herkend door de T-cellen,is dat meetbaar door een toename in de celdeling,ook wel proliferatie genoemd.Dergelijke experimenten zijn de basis voor de onderzoeken die zijn beschreven in dit proefschrift. Het enzym tissue transglutaminase.De laatste belangrijke factor die een rol speelt in coeliakie is het enzym tissue transglutaminase (tTG).Dit is een enzym dat overal in het lichaam voorkomt en een rol speelt bij het herstel van beschadigd weefsel. In relatie tot coeliakie werd gevonden dat tTG de glutenspecifieke T-celreacties kan beïnvloeden.tTG modificeert namelijk glutenpeptiden,waardoor ze beter binden aan hla-dq 2-eiwitten.Dit leidt tot een langere en betere presentatie van de glutenpeptiden en daardoor een sterkere T-celreactie.

Dit proefschrift
Identificatie van schadelijke bestanddelen in gluten voor jonge kinderen.Toen ik begon met mijn promotieonderzoek was het samenspel van de hierboven beschreven factoren bij coeliakie net duidelijk geworden (zie ook figuur 2 ,pag.18).Er waren op dat moment een aantal glutenpeptiden geïdentificeerd waartegen T-cellen uit de darm van patiënten reageren.Echter de rol van deze peptiden en omvang van de glutenspecifieke T-celreacties in het ziekteproces waren onduidelijk.Daarom hebben we gezocht naar de peptiden die een belangrijke rol spelen in coeliakie.Als de ziekte namelijk veroorzaakt wordt door één bepaald fragment uit gluten zou dat een mogelijkheid bieden om tarwe onschadelijk te maken door aanpassing van die component. Als meerdere fragmenten in gluteneiwitten schadelijk zijn wordt het natuurlijk ingewikkelder om tarwe veilig te maken voor consumptie door coeliakiepatiënten.We hebben onderzocht welke glutenpeptiden een T-celreactie opwekken in de darm van jonge coeliakiepatiënten (hoofdstuk 2 ).Zo hoopten we in staat te zijn de peptiden te definiëren die een rol spelen bij het ontstaan van de ziekte.De uitkomst was onverwacht,omdat bleek dat een groot aantal peptiden een T-celreactie konden veroorzaken in de vroege stadia van de ziekte.Deze diversiteit in de schadelijke glutenpeptiden bleek bij kinderen zelfs nog groter te zijn dan bij volwassen patiënten. Op basis daarvan concludeerden wij dat coeliakie kan ontstaan ten gevolge van T-celreacties tegen een groot aantal verschillende glutenpeptiden,maar dat de sterkste T-celreacties uitgroeien en gaan domineren in latere fases van de ziekte. Invloed van tTG.Modificatie van glutenpeptiden door tTG versterkt meestal de glutenspecifieke T-celreactie omdat de affiniteit van het peptide voor hla-dq 2 wordt verbeterd.De modificatie door tTG blijkt zeer specifiek te zijn,de peptiden worden slechts op bepaalde posities veranderd.Een modificatie op een andere plek in het glu tenpeptide heeft zelfs een averechts effect op herkenning door de T-cellen.De specifi citeit van tTG,is afhankelijk van de aminozuurvolgorde in het peptide.Aangezien de T-celherkenning van een groot aantal schadelijke glutenpeptiden afhankelijk is van de modificatie door tTG,hebben we de specificiteit van tTG onderzocht.Vervolgens hebben we zoekpatronen ontworpen die gebaseerd zijn op de specificiteit van tTG en de voorwaarden waaraan peptiden moeten voldoen om te binden aan hla-dq 2. Met deze zoekpatronen waren we in staat nieuwe schadelijke glutenpeptiden in databanken voor gluteneiwitten te voorspellen (hoofdstuk 3 ).Deze databanken zijn te benaderen via internet en bevatten informatie over de structuur van eiwitten.Met deze studie werd bovendien duidelijk dat de eiwitstructuur van gluten in combinatie met de invloed van tTG,de vorming van een groot aantal T cel stimulerende gluten- peptiden mogelijk maakt. Schadelijke componenten in andere granen.Met de hierboven beschreven methode was ook het mogelijk om behalve in gluten (tarwe)databanken ook in hordeïne (gerst),secaline (rogge)en avenine (haver)databanken te zoeken.Het was bekend dat rogge en gerst vaak ziekteverschijnselen opwekken bij coeliakiepatiënten

en dat haver meestal veilig is;de oorzaak van dit verschil tussen de granen was echter onbekend.Wij vonden met de zoekpatronen,zowel in rogge als in gerst,een groot aantal peptiden net als in tarwe.In de havereiwitten waren deze peptiden veel schaarser of afwezig.Dit correleerde dus goed met de toxiciteit van de verschillende granen in het dieet van coeliakiepatiënten (hoofdstuk 3 ).Vervolgens hebben we op basis van het verschil in de eiwitstructuur tussen haver en de andere granen bepaald welke eiwitsequenties cruciaal zijn in de toxiciteit van het graan.Het bleken maar subtiele verschillen te zijn,zodat het mogelijk was om toxische peptiden onschadelijk te maken door verandering van een enkel aminozuur.Deze resultaten bieden daarom mogelijkheden om in de toekomst granen te selecteren of aan te passen,zodat ze veilig zijn voor consumptie door coeliakiepatiënten (hoofdstuk 4 ). Coeliakie &hla-dq 2.In de tot dusver beschreven studies hebben we een goed beeld gekregen waarom bepaalde granen toxisch zijn voor coeliakiepatiënten.Tarwe,rogge en gerst bevatten een groot aantal peptiden die een ongewenste T-celreactie kunnen opwekken.Dit gebeurt echter niet bij alle personen die hla-dq 2 bezitten.Homozygote individuen hebben bovendien een sterk verhoogd risico om coeliakie te krijgen ten opzichte van heterozygote individuen.Dit wordt het gendosis-effect genoemd. In de laatste studie is onderzocht hoe dit gendosis-effect de glutenspecifieke T-celreacties beïnvloedt (hoofdstuk 5 ).Het verschil bleek puur kwantitatief te zijn:hoe meer hla-dq 2 aanwezig is om glutenpeptiden te presenteren aan de T-cellen,hoe sterker de T-celreactie.In hla-dq 2 homozygote individuen ontstaat dus met dezelfde hoeveelheid gluten een sterkere T-celreactie die sneller leidt tot ontwikkeling van coeliakie.Door dit nieuwe inzicht,ontstaan mogelijkheden voor preventie van coeliakie bij personen met een verhoogd risico voor de ziekte.Van de Nederlandse populatie is ongeveer 2%bevolking homozygoot voor hla-dq 2.Deze individuen zouden op jonge leeftijd opgespoord kunnen worden,bijvoorbeeld bij de hielprik kort na de geboorte. Voor de aldus opgespoorde personen zou de introductie van gluten in hun dieet heel geleidelijk kunnen plaatsvinden en niet plotseling en in grote hoeveelheden,zoals nu gebruikelijk is.Met een geleidelijker opbouw van de hoeveelheid graan in het dieet kan een te sterke stimulatie van de T-cellen worden voorkomen,zodat de tolerantie voor gluten ook intact blijft bij personen met een verhoogde kans op coeliakie. Deze voorgestelde preventieve maatregelen zullen uiteraard eerst onderzocht moeten worden.

Tenslotte
Het onderzoek dat beschreven is in dit proefschrift heeft ons inzicht in de toxiciteit van granen voor coeliakiepatiënten sterk vergroot.Met de beschreven methoden wordt het mogelijk om in de toekomst granen te selecteren die een laag gehalte aan schadelijke peptiden bevatten.Resterende toxische elementen kunnen vervolgens nog gericht worden verwijderd door enzymatische behandeling of andere aanpassingen op eiwit of DNA niveau.Tegelijkertijd schept het nieuwe inzicht in de aanleg voor coeliakie mogelijkheden om de ziekte te voorkomen.Zowel op het gebied van preventie van de ziekte als op het gebied van ontwikkeling van veilig graan hebben we grote vooruitgang geboekt.Ik hoop daarom dat deze onderzoeksresultaten een bijdrage zullen leveren aan de preventie en de behandeling van coeliakie.

Summary

Coeliac disease patients have developed an irreversible intolerance towards wheat (and other grains)present in food products.The results described in this thesis indicate that development of disease is tightly linked to a quantitative interplay between the hla-dq 2 gene-dose and the number of gluten peptides that can be presented by the hla-dq 2 molecule.The basis for this novel insight and the implications for intervention and prevention in the disease process are discussed in this chapter.

Gluten epitopes
At the start of this PhD project gluten-specific T cell clones had been generated from the small intestine of patients [1,2 ],and the first T cell stimulatory gluten peptides were characterised [3-5 ].Soon it became clear that additional T cell stimulatory peptides existed,because a large number of the T cell clones failed to recognise the already identified epitopes.The subsequent studies therefore aimed at the identification of immunodominant or disease initiating gluten epitopes.The hope was that characterisation of such gluten peptides would enable novel intervention protocols like tolerance induction protocols for coeliac disease patients,or the development of safer grains by elimination of toxic sequences.Obviously,these strategies require a minimum of toxic gluten epitopes in order to be feasible.The first studies with glutenspecific T cells from adult patients indeed described immunodominant recognition of a g -gliadin epitope in the context of hla-dq 8 [4 ],and two a -gliadin epitopes,the Glia-a 2,and the Glia-a 9 in the context of hla-dq 2 [6,7 ].Meanwhile,we studied the gluten-specific T cell responses in young patients during the early stages of disease. Unexpectedly,the gluten-specific T cell responses found in young patients were more heterogeneous compared to the responses found in adults (Chapter 2 ).This led us to postulate that T cell responses in the small intestine can be initiated against a large panel of gluten peptides,while at later stages in the disease the responses focus 98 towards recognition of the strongest T cell stimulatory gluten peptides.Additional evidence for this theory was that in the young patients T cell responses were directed against native and deamidated peptides whereas the immunodominant responses in adults were all dependent on deamidation.The weaker initial responses against (native)gluten peptides are thus likely to be overtaken by the clonal outgrowth of more vigorous responses against deamidated peptides.Unfortunately,this finding complicated potential approaches for treatment of coeliac disease,because elimination of a single epitope-specific T cell response would most likely be counteracted by the outgrowth of existing T cell responses against other gluten epitopes. Subsequent studies reinforced our postulate that multiple gluten peptides can induce gluten-specific T cell responses in patients.Different approaches yielded the characterisation of additional epitopes in gluten (Chapter 3 )[8 ],in hordeins from barley,and in secalins from rye (Chapter 3 &4 ).However,the current list of 15 gluten epitopes plus homologues is still incomplete.First,we have remaining gluten-specific T cell clones that failed to recognise the characterised epitopes.Second,the generation of hordeinand secalin-specific T cell lines is likely to reveal a new source of T cell specificities.

The threshold of gluten tolerance
The grain epitopes are not the only important factor in development of coeliac disease. Large numbers of potential harmful gluten sequences were found to exist that do not necessarily cause coeliac disease in genetically predisposed individuals,because 25%of the Dutch population carries the disease associated hla-dq 2 molecule [9 ],and only 0.5%of the population is diagnosed with coeliac disease.Other key factors were therefore expected to play an important role in the basis of coeliac disease pathogenesis.Chapter 5 of this thesis provides evidence that the number of hla-dq 2-peptide complexes that can be formed has a critical and limiting effect on gluten-specific T cell responses.The long-standing hla-dq 2 gene-dose effect in the risk to develop coeliac disease [10-13 ] was found to correlate with the magnitude of the gluten--specific T cell responses.Thus,hla-dr 3,dq 2 homozygous and hla-dr 3/7,dq 2 heterozygous individuals,that express the highest levels of the disease associated hla-dq 2 molecules, display the strongest gluten-specific T cell responses and the highest risk for coeliac disease.Gluten recognition in the context of low-risk genotypes (e.g.hla-dr 7 ,dq 2) is qualitatively indistinguishable from gluten recognition in the context of high-risk genotypes.However,the breadth of the T cell-specificities and/or the strength of the gluten-specific T cell responses are found superior in the context of high risk hla - genotypes.In addition,while coeliac disease pathogenesis comprises a large spectrum from asymptomatic to severe malabsorption,this has not been correlated so far with the genetic background of the patients.Therefore,it seems that once established, coeliac disease is independent of the genotype of the patient.Together,this suggests the presence of a threshold that must be crossed before disease can develop,which is most rapidly achieved in the individuals that raise the strongest immune responses against gluten.Why the intestinal immune system fails in this respect is unknown. Inadequate mechanisms of active suppression,clonal deletion or anergy of gluten reactive T cells,and inappropriate costimulatory signals could contribute to the development of gluten intolerance [14 ].However,once oral tolerance is broken only minute amounts of grains are sufficient to trigger a recall response irrespective of the genotype,which entails the lifelong gluten intolerance in patients.This novel understanding of the critical role of hla-dq 2 in coeliac disease provides possibilities for new approaches to prevent coeliac disease.

Prevention for individuals at risk
Most importantly,prevention should focus on a well-defined risk group based on the hla genotype.Individuals that do not classify in the risk group can be excluded without further follow-up.The inclusion criteria of the risk group should be determined by screening of the current patient population,but obviously the hla-dr 3,dq 2 and hla-dr 3/7,dq 2 genotypes should be included (Chapter 5 ).The latest screening in a Dutch panel of healthy blood donors shows that the hla-dr 3/hla-dq 2 homozygous and hla-dr 3/7,dq 2 heterozygous haplotypes both comprise 1-2%of the population [9 ].According to a Spanish study these two genotypes account for 50%of the coeliac disease population [11 ].In the Netherlands such data are not yet available,but if similar percentages of the hla-dr 3/hla-dq 2 homozygous and hla-dr 3/7,dq 2 heterozygous genotypes contribute to the Dutch patient population,aiming at this risk group for prevention is worthwhile.In addition,specific attention is required for the hla-dr 5/7 genotype,because it lacks the disease associated hla-dq 2 molecule in cis , but has an elevated risk due to expression of an identical molecule in trans (Chapter 5 ) [15 ],and a non-disease associated hla-dq 2 molecule in cis [11 ].Accurate determination of the relative risk for this group and other less unambiguous genotypes should indi cate the necessity to include such genotypes for disease prevention.Furthermore,hla - typing of families with multiple cases of coeliac disease should indicate whether in these patients coeliac disease can be assigned to the known high risk hla genotypes, or that other (unknown)genetic factors play a role.In the latter case,inclusion of such families should also be considered. For maximum benefit,young children should be screened before the first gluten intake.In The Netherlands,and in most European countries,children are restricted to a gluten-free diet until seven months of age.A good opportunity for screening may thus be provided by the national screening program for congenital metabolic defects shortly after birth that covers virtually all infants in ample time before the first introduction of grain in the diet.

Stay below the threshold of tolerance
The standard method for disease prevention in the selected risk group would comprise a lifelong gluten-free diet.Data described in this thesis,however,point to an attractive alternative:the gradual introduction of gluten and other grain proteins in the diet.Our results indicate that homozygous hla-dr 3,dq 2 and heterozygous hla-dr 3/7,dq 2 individuals raise a stronger T cell response against gluten due to the higher amount of hla-dq 2-peptide complexes that can be formed in the small intestine (Chapter 5 ).Antigen presentation of gluten peptides by APCs heterozygous for hla-dq 2 resulted in significantly lower T cell responses.Thus,homozygous hla-dr 3,dq 2 and heterozygous hla-dr 3/7,dq 2 individuals have an enhanced risk to develop a rapidly progressing immune response against gluten due to their high number of hla-dq 2 molecules,which could result into breaking of oral tolerance and development coeliac disease.Since reduction of the number of hla-dq 2 molecules present results in a significantly reduced risk of developing disease (low risk genotypes),reduction of the daily intake of gluten may have a very similar effect.Currently there are no restrictions to gluten intake after the age of seven months,consequently 12 months-old infants consume between 6 and 9 grams gluten daily.Considering that in gluten some fifty immunogenic peptide sequences are present and microgram amounts are sufficient to trigger recall T cell responses,it is surprising that tolerance to gluten is established in the majority of hla-dq 2 positive individuals.We therefore suggest that a more gradual introduction of gluten in the diet may prevent the immune system to exceed its limits,and instead lead to induction of proper oral tolerance in individuals prone to develop disease. Obviously,this hypothesis requires validation for the in vivo situation.The experimental set-up therefore is now very straightforward.Infants homozygous hla-dr 3,dq 2 or heterozygous hla-dr 3/7,dq 2 should be selected before the first gluten intake.This could also include families with high prevalence of coeliac disease. These individuals should subsequently be divided into two groups of which the first group receives a normal diet with first grain intake at a certain time point (seven months is normal in The Netherlands).The second group starts gluten intake from the same time point,but is restricted to low amounts of grains in the initial phase that is increased over a fixed period of time.The exact amounts of grains and the time span should be determined in consultation with paediatricians,dieticians,and immunol ogists.In addition,a third group could be subjected to the first low amounts of gluten intake during the breast feeding period after which a similar gradual increase of the gluten intake should follow.Initial gluten intake during the breast-feeding period was previously shown to be beneficial,most likely because it provides a tolerogenic milieu that could contribute to the proper establishment of oral tolerance [16 ]. The groups can be monitored by observation of coeliac disease symptoms,anti-tTG antibodies in the serum,and a small intestinal biopsy could be applied for the final evaluation.Further longitudinal studies should follow these individuals over longer periods of time.In the case of a positive outcome of this approach,further studies will be required to determine the safe doses of grain proteins during the early years of children in the risk group. The novel perspective on the pathogenesis of coeliac disease also provides opportunities for the generation of safe wheat or other grains.According to our observations T cell responses against gluten do not necessarily lead to development of disease, because hla-dr 7,dq 2 individuals rarely develop coeliac disease while inflammatory gluten-specific T cell responses can be raised.Limited gluten recognition is thus most likely tolerated.This implies that safe wheat can be generated by elimination of most of the T cell epitopes.A rational strategy was described in chapter 4 of this thesis, based on prior selection of less toxic wheat species by database searches with known epitopes,or with the use of predictive algorithms (Chapter 3 ).Subsequent elimination of the T cell stimulatory capacity can be achieved by relatively subtle changes on the DNA level.Alternatively,local blocking of hla-dq 2,inhibition of tTG activity to prevent the generation of neo-epitopes or proteolytic degradation of harmful gluten sequences during ingestion [17 ] potentially could lower the hla--dq 2-gluten complexes below critical levels.However,this would imply addition of such agents to all gluten containing meals for a certain period of time.In conclusion,generation of high concentrations of hla-dq 2-gluten peptide complexes should be avoided so that the residual T cell responses should not provoke the breaking of tolerance.

Conclusion
Four years ago we engaged in a study to define the toxic components of wheat proteins for coeliac disease patients.Immunodominant epitopes were indeed characterised for adult patients [4,6,7 ].However,studies in young patients showed large heterogeneity in the gluten-specific T cell responses (Chapter 2 ),and later also in adults other T cell specificities were detected (Chapter 2 )[8 ].Subsequent studies showed that the individual epitopes were most likely not the cause of gluten toxicity,but that recurrent motifs present in grain proteins in combination with the specificity of tTG and the peptide binding requirements of hla-dq 2 form a unique but unfortunate combination (Chapter 3 &4 ).Finally,in the last study described in this thesis,a novel perspective is provided on the interplay of factors that cause coeliac disease (Chapter 5 ). This lead us to conclude that not gluten is the limiting factor that determines whether individuals develop coeliac disease,but rather the hla-dq 2 gene-dose !Nonetheless, the amount of gluten can be rendered limiting by reduction of the immunogenic grain dose in the diet,thus providing a relatively simple tool to prevent development of coeliac disease in the near future.

References
1.Lundin KE,Scott H,Hansen T,Paulsen G,Halstensen TS,Fausa O,Thorsby E,and Sollid

LM.1993.Gliadin specific,hla-dq (a 1*0501,b 1*0201)restricted T cells isolated from the

small intestinal mucosa of celiac disease patients.J.Exp.Med.178:187-196.

2.Lundin KE,Scott H,Fausa O,Thorsby E,and Sollid LM.1994.T cells from the small

intestinal mucosa of a dr 4,dq 7/dr 4,dq 8 celiac disease patient preferentially recognize

gliadin when presented by dq 8.Hum.Immunol .41:285-291.

3.Sjöström H,Lundin KE,Molberg Ø,Körner R,McAdam SN,Anthonsen D,Q uarsten H,

Norén O,Roepstorff P,Thorsby E,and Sollid LM.1998.Identification of a gliadin T-cell

epitope in coeliac disease:general importance of gliadin deamidation for intestinal T-cell

recognition.Scand.J.Immunol .48:111-115.

4.Van de Wal Y,Kooy YM,Van Veelen PA,Peña SA,Mearin LM,Molberg Ø,Lundin KE,

Sollid LM,Mutis T,Benckhuijsen WE,Drijfhout JW,and Koning F.1998.Small intestinal

T cells of celiac disease patients recognize a natural pepsin fragment of gliadin.Proc.Natl.

Acad.Sci.USA 95:10050-10054.

5.Van de Wal Y,Kooy YM,Van Veelen P,Vader W,August SA,Drijfhout JW,Peña SA,and

Koning F.1999.Glutenin is involved in the gluten-driven mucosal T cell response.Eur.

J.Immunol .29:3133-3139.

6.Anderson RP,Degano P,Godkin AJ,Jewell DP,and Hill AV.2000.In vivo antigen chal-

lenge in celiac disease identifies a single transglutaminase-modified peptide as the domi-

nant a -gliadin T-cell epitope.Nat.Med .6:337-342.

7.Arentz-Hansen H,Körner R,Molberg Ø,Q uarsten H,Vader W,Kooy YM,Lundin KE,

Koning F,Roepstorff P,Sollid LM,and McAdam SN.2000.The intestinal T cell response

to a -gliadin in adult celiac disease is focused on a single deamidated glutamine targeted

by tissue transglutaminase.J.Exp.Med .191:603-612.

8.Arentz-Hansen H,McAdam SN,Molberg Ø,Fleckenstein B,Lundin KE,Jorgensen TJ,

Jung G,Roepstorff P,and Sollid LM.2002.Celiac lesion T cells recognize epitopes that

cluster in regions of gliadins rich in proline residues.Gastroenterology 123:803-809.

9.Schipper RF,Schreuder GM,D ’Amaro J,and Oudshoorn M.1996.hla gene and haplo-

type frequencies in Dutch blood donors.Tissue Antigens 48:562-574.

10.Louka AS,Nilsson S,Olsson M,Talseth B ,Lie BA,Ek J,Gudjónsdóttir AH,Ascher H,and

Sollid LM.2002.hla in coeliac disease families:a novel test of risk modification by the

‘other ’haplotype when at least one dq a 1*05-dq b 1*02 haplotype is carried.Tissue Antigens

60:147-154.

11.Mearin ML,Biemond I,Peña AS,Polanco I ,Vazquez C,Schreuder GT,de Vries RR,and

Van Rood JJ.1983.hla-dr phenotypes in Spanish coeliac children:their contribution to

the understanding of the genetics of the disease.Gut 24:532-537.

12.Mearin ML,Bouquet J,Mourad N,Schoorel E,Sinaasappel M,Biemond I,Schreuder GM,

Peña AS,Van Gelderen HH,and Van Rood JJ.1985.hla-dr antigens and phenotypes in

Dutch coeliac children and their families.Clin.Genet .27:45-50.

13.Ploski R,Ek J,Thorsby E,and Sollid LM.1993.On the hla-dq (a 1*0501,b 1*0201)-associ-

ated susceptibility in celiac disease:a possible gene dosage effect of dq b 1*0201.Tissue

Antigens 41:173-177.

14.Sollid LM.2002.Coeliac disease:dissecting a complex inflammatory disorder.Nat.Rev.

Immunol .2:647-655.

15.Sollid LM,Markussen G,Ek J,Gjerde H,Vartdal F,and Thorsby E.1989.Evidence for

a primary association of celiac disease to a particular hla-dq a /b heterodimer.J.Exp.

Med.169:345-350.

16.Ivarsson A,Hernell O,Stenlund H,and Persson LÅ.2002.Breast-feeding protects against

celiac disease.Am.J.Clin.Nutr .75:914-921.

17.Shan L,Molberg Ø,Parrot I,Hausch F,Filiz F,Gray GM,Sollid LM,and Khosla C.2002.

Structural basis for gluten intolerance in celiac sprue.Science 297:2275-2279.